IMQ-유도 건선 피부모델에서 木通 추출물의 피부 염증 조절과 각질세포 증식 억제에 미치는 효과

Ⅰ. 서 론

건선은 표피 각질세포의 과증식과 면역세포 활성화, 피부장벽 이상이 복합적으로 작용하는 만성 재발성 피부질환으로¹⁾ 대사증후군, 심혈관질환 등 다양한 전신 질환과 연관된 염증 질환으로 인식되고 있으며, 전 세계 인구의 약 2-3%가 이환되어 있다^2,3).

건선의 치료에는 국소제, 광선요법, 면역억제제, 생물학적 제제가 사용되며, TNF-α, IL-17, IL-23 억제제가 대표적이다⁴⁾. 그러나 장기 사용 시 감염이나 악성종양 등의 부작용이 있어서 상대적으로 안전한 치료제에 대한 필요성이 점차 강조되고 있다^5,6).

한의학에서는 건선을 白疕·銀屑이라 하고, 血熱, 血燥, 血瘀 등의 병인에 따라 淸熱涼血·養血潤燥·活血祛瘀의 치법을 적용해 왔다^7,8). 최근에는 이러한 한의학적 병리 개념이 IL-17 및 TNF-α 중심 염증 기전과 상관성이 있다는 해석도 제시되고 있어, 천연물 기반 치료 후보 탐색의 이론적 배경을 제공한다⁹⁾.

木通(Akebia quinata, AQ)은 으름덩굴과에 속하는 낙엽 활엽 덩굴식물로, triterpenoid saponinns, flavonoid 등이 주요성분이며 이뇨, 소염, 진통, 淸熱利濕의 효능이 있다^10,11). 기존의 木通 관련 연구로는 항염증, 항산화, 항노화, 항암, 심혈관 보호, 간 재생, 신경 보호, 진통 효과와 고지방식이 모델에서 지질대사 개선 효과 등이 있다^10,12-15). 그러나 이런 광범위한 효능에도 불구하고 건선과 연관된 피부 염증 조절, 각질세포 증식 억제, 건선 피부염 개선 효과를 평가한 연구는 아직까지 접하지 못하였다.

이에 본 연구에서는 IMQ-유도 건선 피부염 모델에 木通 추출물을 사용하여, 피부 염증 반응과 각질세포 증식 이상의 건선에서 관찰되는 주요 표현형들을 중심으로 효능을 평가하였다. 그에 따라, 정상 인간 진피 섬유아세포(Normal Human Dermal Fibroblast, NHDF) 및 JB6 세포 기반의 in vitro 염증·세포 변형 억제 실험, RAW 264.7 대식세포에서의 IL-6 및 TNF-α 조절 효과, Imiquimod(IMQ) 유도 마우스 건선 피부염 모델을 이용한 in vivo 효능 평가, H&E 및 Ki-67 면역조직화학 분석을 통한 표피 비후 및 세포증식 지표를 평가하여 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 재료

1) 시료

본 연구에 사용된 木通은 대한민국 경상북도 청송군에서 채취된 것으로, 시료는 한국한의학연구원 한약 표준 자원은행에서 표본 관능 감정(sensory authentication) 및 유전자 분석(gene authentication)을 통해 Akebia quinata 종으로 정확히 동정되었으며, 감별 시험서 및 유전자분석 인증서는 한약 표준 자원은행에서 발급된 확인서와 같이 규명되었다(Fig. 1, 2). 약용 부위는 줄기로서 주피를 제거한 부분이다. 채취 및 가공은 가을철에 줄기를 채취하여 잔가지를 제거한 후 그늘에서 충분히 건조하였다.

Fig. 1. Sensory Test Certificate for Akebia quinata from The Standard Herbal Medicine Resources Bank, Korea Institute of Oriental Medicine

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Fig. 2. Gene Analysis Certificate for Akebia quinata from The Standard Herbal Medicine Resources Bank, Korea Institute of Oriental Medicine

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(1) 木通 물 추출물 (Akebia quinata Water Extract, AQW)

건조된 木通 시료에 중량 대비 약 10배의 증류수를 첨가하고, 3시간 동안 환류 추출을 수행하였다. 추출 후, 여과 및 농축 과정을 거쳐 동결 건조했으며, 최종 수득률은 12.72%로 확인되었다.

(2) 木通 에탄올 추출물 (Akebia quinata Ethanol Extract, AQE)

木通 시료에 중량 대비 약 10배의 70% 에탄올을 첨가하고 35 ± 1℃에서 1시간 동안 추출을 2회 반복하여 추출하였다. 추출된 용액은 여과 및 농축 과정을 거쳐 동결 건조하였으며, 최종 수득률은 10.43%였다.

AQW 및 AQE는 한국한의학연구원 한약자원연구센터의 한약 표준 자원은행(Herbal Medicine Resources Research Center, Korea Institute of Oriental Medicine, Naju, Korea) 으로부터 분양받아 사용하였으며, 수령 후에는 –20℃에 보관하였다. 실험 전 AQW는 증류수를 이용하여, 에탄올 추출물은 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 이용하여 200㎎/㎖의 농도로 stock solution을 제조한 후–20℃에 보관하고, 최종 농도로 희석하여 사용하였다.

2) 시약 및 기구

본 연구의 세포 배양에 필요한 minimum essential medium(MEM), Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM), Medium199, fetal bovine serum(FBS), penicillin/streptomycin (P/S), sodium pyruvate(SP), minimum essential medium non-essential amino acid(MEM NEAA), trypsin-EDTA는 Gibco(Grand Island, NY, USA)에서 구매하였으며, DMSO, basal medium eagle(BME), IMQ, clobetasol propionate는 Sigma-Aldrich, Inc.(St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다. WST-8 Cell Viability Assay Kit는 Biomax(Seoul, Republic of Korea)에서, Multiskan SkyHigh Spectrophotometer는 ThermoScientific(Vantaa, Finland) 제품을 사용하였다. 실험에 사용된 모든 시약은 분석급 이상을 사용하였다.

Ⅲ. 결 과

1. 木通 추출물의 정상 세포에 대한 독성 평가

NHDF 세포에 AQE와 AQW를 각각 1.56–100 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후, 24시간 및 48시간 배양 후 세포 생존율을 측정한 결과, 48시간 세포 생존율이 AQE는 100㎍/㎖까지, AQW는 25㎍/㎖까지 처리했을 때 80% 이상으로 유지되어 각각의 비독성 농도 범위를 확인하였다(Fig. 3).

Fig. 3. Cytotoxic Effect of Akebia quinata Ethanol Extract and Water Extract on NHDF Cells. NHDF were treated with various concentrations (1.56–100 ㎍/㎖) of AQE or AQW for 24 h and 48 h, respectively. Cell viability was determined using the WST-8 assay. Data are expressed as mean ± SD.

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2. 木通 추출물의 TPA-유도 JB6 C141 세포 변형에 대한 억제 효과

木通 추출물이 TPA에 의해 유도되는 JB6 Cl41 세포의 형태학적 변형을 억제하는지 평가하기 위해 soft agar assay를 수행한 결과, TPA(10ng/㎖) 처리군에서 JB6 C141 세포는 뚜렷한 colony 형성을 보였으나, AQE 및 AQW 처리군에서는 농도 의존적으로 colony 수와 크기가 유의하게 감소하였다(Fig. 4).

Fig. 4. Representative Images Showing the Inhibitory Effects of Akebia quinata Ethanol Extract and Water Extract on TPA-induced JB6 C141 Cell Transformation. JB6 Cl41 cells were cultured in 0.3% agar over a 0.5% agar base layer containing 10 ng/㎖ TPA and treated with either AQE (25–100 ㎍/㎖) or AQW (6.25–25 ㎍/㎖). After 14 days of incubation, colony formation was visualized under an inverted microscope. Representative images of the soft agar colony formation were obtained by microscope at a magnification of 40×.

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또, AQE 100㎍/㎖ 처리군에서 colony 형성 수는 TPA 단독군 대비 약 51.5% 이상 감소하였으며, AQW 25㎍/㎖ 처리군에서 45.0%가 감소하였다(Fig. 5).

Fig. 5. Quantitative Analysis of The Inhibitory Effects of Akebia quinata Ethanol Extract and Water Extract on TPA-induced JB6 Cell Transformation. The number of colonies formed in soft agar was counted in four randomly selected microscopic fields per well using Image-Pro Plus software (v.6.0, Media Cybernetics, USA). Results are expressed as mean ± SD from three independent experiments. Significant differences between the untreated control group and the treated groups were analyzed; ###p<0.001 compared to untreated control group. **p<0.01 and ***p<0.001 compared to TPA-treated group.

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3. IMQ-유도 염증반응에서의 木通 추출물의 억제 효과

木通 추출물이 IMQ에 의해 유도되는 염증성 사이 토카인 분비 반응에 미치는 영향을 규명하기 위해 실험을 수행한 결과, RAW 264.7 대식세포에 IMQ (5㎍/㎖)를 처리하였을 때, 염증 매개 경로가 활성화되면서 TNF-α 및 IL-6의 분비가 6시간 처리 기준에서 유의하게 증가하였다(Fig. 6). RAW 264.7 세포에 IMQ와 함께 AQE(50㎍/㎖) 또는 AQW(6.25㎍/㎖) 를 처리하였을 때, 두 추출물 모두 IMQ-유도 TNF-α 및 IL-6 분비를 억제하였다. 한편 동일 조건에서 수행한 WST-8 세포 생존율 분석에서, AQE(25-100㎍/㎖) 및 AQW(6.25-25㎍/㎖) 처리 시 85% 이상의 생존율이 유지되었다(Fig. 7).

Fig. 6. Inhibitory Effects of Akebia quinata Extracts on IMQ-induced Proinflammatory Cytokine Production in RAW 264.7 Macrophages. RAW 264.7 cells were treated with AQE (50㎍/㎖) or AQW (6.25㎍/㎖) simultaneously with IMQ (5㎍/㎖) for 6 h. The concentrations of TNF-α (A) and IL-6 (B) in the culture supernatants were quantified using ELISA kits according to the manufacturer’s instructions. Data are presented as the mean ± SD.

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Fig. 7. Cytotoxicity of Akebia quinata Extracts in RAW 264.7 Macrophages. RAW 264.7 cells were treated with AQE (1.56–100 ㎍/㎖) or AQW (1.56–100 ㎍/㎖) for 24, 48 h without IMQ stimulation. Cell viability was assessed using the WST-8 cell viability assay, and absorbance was measured at 450㎚. Results are expressed as the percentage of viable cells relative to the vehicle (0.1% DMSO) control group. Data are presented as the mean ± SD.

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4. 木通 추출물의 건선 피부염 마우스 모델에서의 효과

C57BL/6 수컷 마우스에 Aldara 크림(5% IMQ)을 등 부위에 6일간 도포하여 건선 피부염 모델을 유도하였다(Fig. 8A).

Fig. 8. Experimental Timeline and Body-weight Changes in IMQ-induced Psoriasis Skin Inflammation Model. (A) Experimental timeline showing the topical application of Akebia quinata extracts and IMQ. C57BL/6 male mice (10 weeks old, Samtako Bio Korea) were shaved, and after 4 days, IMQ (3.125㎎ per mouse, Aldara® 5% cream) was applied daily to the dorsal skin for 6 consecutive days. AQE (50–100 ㎎/㎏) or AQW (12.5–25 ㎎/㎏) or clobetasol 0.05% (Sigma-Aldrich) were dissolved in acetone and topically applied 30 min before IMQ treatment. (B) Body-weight monitoring during the experimental period. Data are expressed as mean ± SEM (n = 4–6 per group).

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1) 체중 변화

IMQ 처리 후 2–3일 차에 일시적인 체중 감소를 보 였으나, 4일차 이후부터는 점진적으로 회복되는 경향을 보였다. 반면, 木通 추출물(AQE 100㎎/㎏, AQW 25㎎/㎏) 단일 처리군에서는 실험 기간 동안 유의한 체중 감소가 관찰되지 않았다(Fig. 8B).

2) 피부 병변의 육안적 변화

IMQ 단독 처리군에서는 도포 3일차부터 등 부위에 뚜렷한 홍반, 인설, 피부 비후가 관찰되었다(Fig. 9). 도포 6일차에는 병변 부위가 확대되어 전형적인 건선 피부염 양상이 나타났다 (Fig. 10). 이에 반해 木通 추출물(AQE, AQW) 처리군에서는 이러한 피부 병변이 완화되는 것을 확인하였다. 특히 AQW 12.5㎎/㎏ 처리군에서는 홍반과 인설이 가장 효과적으로 억제되었 으며, 피부 표면 상태가 Clobetasol 0.05% 처리군과 유사한 수준으로 회복되었다. AQE 처리군에서도 농도 의존적으로 증상이 완화되었으나, 그 효과는 AQW 12.5㎎/㎏ 처리군보다 다소 낮았다. AQE 또는 AQW 단독 처리군에서는 육안적 이상이 관찰되지 않았다(Fig. 10).

Fig. 9. Representative Photographs of Dorsal Skin Lesions on Day 3 in IMQ-induced Psoriasis Mice. Images show early-stage erythema, scaling, and thickening of dorsal skin following IMQ application. AQE (50–100 ㎎/㎏) and AQW (12.5–25 ㎎/㎏) treatment visibly alleviated erythema and scaling compared with the IMQ-alone group, exhibiting a concentration-dependent protective effect.

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Fig. 10. Representative Photographs of Dorsal Skin Lesions on Day 6 in IMQ-induced Psoriasis Mice. After 6 days of IMQ application, severe erythema, scaling, and hyperkeratosis were evident in the IMQ-treated group. Both AQE and AQW markedly reduced these psoriasis symptoms. The AQE 100 ㎎/㎏ group showed the most pronounced improvement, comparable to the clobetasol 0.05 %-treated group.

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3) PASI-like 점수 변화

건선 병변의 정량적 지표로서 홍반, 인설, 피부 두께의 정도에 기초한 PASI-like 점수를 측정한 결과, IMQ 처리군은 투여 3일차부터 PASI 점수가 급격히 상승하여 5일차에 최대치에 도달하였다. 반면, AQE 및 AQW 처리군에서는 농도 의존적으로 PASI-like 점수가 감소하였다. 특히 AQW 12.5㎎/㎏ 처리군은 IMQ 단독군 대비 약 36.2% 이상의 감소를 보였으며, Clobetasol 0.05% 처리군과 유사한 수준으로 증상이 완화되었다. 한편, AQW 25㎎/㎏ 처리군에서는 피부 비후 및 인설 증가로 인해 PASI 유사 점수가 다소 상승하였으나, 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다(Fig. 11).

Fig. 11. Effects of Akebia quinata Extracts on PASI-like Scores in IMQ-induced Psoriasis Mice. PASI-like scores were determined based on skin thickness, erythema, and scaling. Scoring was conducted daily by blinded observers according to standard criteria. Data are presented as mean ± SD (n = 4~6). #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001 vs. untreated control; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 vs. IMQ group. Data represent mean ± SEM (n = 6).

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5. H&E 염색을 통한 木通 추출물의 조직학적 효과 분석

H&E 염색 결과(Fig. 12, IMQ 단독 처리군) 에서는 표피층의 현저한 비후와 염증세포 침윤의 증가가 관찰되었다. 반면, AQE(50–100㎎/㎏) 및 AQW(12.5–25㎎/㎏) 처리군에서는 이러한 조직학적 변화가 눈에 띄게 완화되었으며, 특히 AQW 25㎎/㎏ 처리군에서는 표피층의 구조가 비교적 정상 형태를 유지하였다. Clobetasol 0.05% 처리군과 비교하여도 더 우수한 표피 보호 및 염증 억제 효과를 보였다.

Fig. 12. Representative Histological Images of H&E-stained Dorsal Skin in IMQ-induced Psoriasis Mice. Paraffin-embedded dorsal skin sections (5㎛) were deparaffinized, rehydrated, and stained with hematoxylin and eosin according to standard protocols. Representative images were captured using a PANNORAMIC Digital Slide Scanner (3DHISTECH Ltd., Budapest, Hungary) at 20× magnification. Scale bars = 100㎛.

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정량 분석 결과(Fig. 13), IMQ 단독 처리군의 평균 표피 두께는 47.2 ± 6.4㎛로 정상군(15.6 ± 1.2㎛)에 비하여 3배 정도 두꺼워졌으며, AQE 100㎎/㎏ 처리군의 평균 표피 두께는 IMQ군 대비 약 33.6% (p < 0.05), AQW 12.5㎎/㎏ 처리군에서는 40.9% (p < 0.01)의 유의한 두께 감소가 관찰되었다.

Fig. 13. Quantitative Analysis of Epidermal Thickness in H&E-stained Dorsal Skin. Epidermal thickness was measured in three randomly selected fields per sample using Image-Pro Plus software (v.6.0, Media Cybernetics, USA). Data are presented as mean ± SEM (n = 3 per group). ###p < 0.001 vs. untreated control, *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001 vs. IMQ-treated group.

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6. Ki-67 면역조직화학 분석을 통한 木通 추출물의 각질형성세포 증식 억제 효과

Ki-67 면역조직화학 염색 결과(Fig. 14)에 제시된 결과에서, IMQ 단독처리군은 표피층 전반에 걸쳐 Ki-67 발현이 관찰되었다. 반면, AQE(50, 100㎎/㎏) 및 AQW(12.5, 25㎎/㎏) 처리군에서는 Ki-67 발현이 현저히 감소하였으며, 특히 AQW 12.5㎎/㎏ 처리군에서 Ki-67 발현이 가장 억제된 양상을 보였다. Clobetasol 0.05% 처리군 또한 Ki-67 발현이 억제된 양상을 보였다 (p < 0.5).

Fig. 14. Representative Immunohistochemical Staining of Ki-67 in Dorsal Skin of IMQ-induced Psoriasis Mice. Paraffin-embedded dorsal skin sections (5㎛) were stained with anti–Ki-67 antibody and visualized using DAB, followed by hematoxylin counterstaining. Images were scanned using a PANNORAMIC Digital Slide Scanner (3DHISTECH Ltd., Budapest, Hungary) at 20× magnification.

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정량 분석 결과(Fig. 15), IMQ 군에서 Ki-67 발현 비율이 대조군 대비 약 4.8배 증가하였으나, AQE 100㎎/㎏군에서는 약 65.0% 이상 감소하였으며(p < 0.001), AQW 25㎎/㎏군에서도 약 69.0% 이상의 유의한 감소 경향이 확인되었다 (p < 0.001).

Fig. 15. Quantitative Analysis of Ki-67 Expression in Dorsal Skin. The proportion of Ki-67-expressing cells was quantified in three randomly selected fields using Image-Pro Plus software (v.6.0, Media Cybernetics, USA). Data are expressed as mean ± SD. ###p < 0.001 vs. untreated control; *p < 0.01, **p < 0.001 vs. IMQ-treated group.

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Ⅳ. 고 찰

건선은 만성 재발성 염증성 피부질환으로, 각질형성세포의 과증식과 면역세포의 과활성화, 염증성 사이토카인의 분비 증가가 특징이다^1,2). 건선의 병태생리는 IL-23/IL-17 면역축(Th17 경로)의 과활성화와 NF-κB, JAK/STAT, MAPK 신호전달 이상으로 설명된다^17,18). 이러한 염증 루프가 지속되면 각질세포의 증식과 염증반응이 악화되어 특징적인 홍반과 인설이 나타난다. 특히 IL-23/IL-17 면역축 은 건선 병리의 핵심 경로로 알려져 있으며, 이 경로는 선천면역세포(대식세포, 수지상세포 등)에서 분비되는 TNF-α, IL-6, IL-1β 등의 염증매개물이 상위 신호로 작용하여 활성화된다^1,2,19-23).

최근 보고에 따르면, 전 세계적으로 건선의 유병률이 꾸준히 증가하고 있으며, 특히 고령층 인구 증가 및 환경적 요인으로 인해 향후 2030년까지 질병 부담이 지속적으로 상승할 것으로 예측된다²⁴⁾. 이러한 사회적 배경에서, 기존의 생물학적 제제나 스테로이드의 장기 사용에 따른 부작용을 보완할 수 있는 천연물 기 반 건선 치료제 개발의 필요성이 더욱 강조되고 있다^5,6,25).

이에 따라, 염증 매개 인자를 조절하는 천연물 후보물질을 발굴하는 것은 건선 치료 연구에서 중요한 접근 전략으로 간주된다^26,27). 실제로 많은 연구에서 천연 추출물이 항염증, 항증식, 항산화 특성을 가지고 있음이 밝혀졌다^28-30). 이러한 증거들은 건선을 포함한 다양한 질병 치료에 천연물의 잠재적 유용성을 보여준다^31-34).

한의학에서는 건선을 白疕·銀屑로 분류하고, 血熱, 血燥, 血瘀 등의 병인에 따라 淸熱涼血·養血潤燥·活血祛瘀의 치법을 적용해 왔다^7,8). 이러한 전통적 병기는 현대 연구에서 제시하는 건선의 병태와 부합한다. 실제로 최근 보고된 생효탁리산(Sinhyotaklisan) 연구에서는 TNF-α, IL-6/IL-8, NF-κB, MAPK, VEGF-HIF-1α 경로가 건선 병태의 중심적 매개임이 확인되었으며, 다성분·다표적 접근이 psoriatic lesion의 염증, 증식, 혈관신생을 동시에 조절하는 데 유효함을 제시하였다³⁵⁾. 또한 건선과 대사증후군·지질대사의 밀접한 연관성을 조명한 연구에서는 혈중 LDL 증가, HDL 감소, 표피 지질 구조 이상 등이 전신 염증과 상호 강화되어 병변의 만성화를 촉진하여, 지질 대사 조절이 건선 치료의 새로운 축이 될 수 있음을 강조하였다³⁶⁾.

이러한 최신 근거들을 종합했을 때, 건선 치료에는 단일 병리를 표적으로 하는 접근보다는, 복합적인 병태를 동시에 조절할 수 있는 치료 전략이 필요함을 알 수 있다. 이러한 배경에서 木通은 피부에서의 항염증 효과뿐만 아니라 고지혈증 개선 효과도 보고된 바 있어, 본 연구에서는 우선 외용제로서의 가능성을 평가하고자 하였다¹²⁾.

木通(Akebia quinata)은 으름덩굴과에 속하는 낙엽 활엽 덩굴식물로, 한의학에서 이뇨, 소염, 진통, 淸熱利濕 효능이 있는 약재로 활용되어 왔다^10,11). 주요 생리활성 성분으로는 akeboside 계 triterpenoid saponins, hederagenin·oleanolic acid 기반 triterpenoids, 그리고 flavonoids 및 phenolic 구성물질이 풍부하게 포함되어 있으며^11,37), 이들 중 akeboside St, hederagenin, oleanolic acid 등의 화합물은 항염증, 항산화, 항노화, 항암, 혈관이완 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다^38-40). 기존 연구에 따르면, 木通 추출물은 이뇨, 간 재생, 신경 보호, 진통, 항염증 및 항비만 효과를 나타낸다^10,12-15).

그러나 木通을 건선과 같은 만성 염증성 피부질환에 적용한 연구는 보고된 바 없다. 木通이 지닌 항염증 및 항산화 활성이 피부 염증 반응과 세포 증식 이상이 복합적으로 얽혀 있는 건선 병태에 유효하게 작용할 가능성이 있다고 판단하였다. 이에 본 연구에서는 木通 추출물이 건선 관련 염증 및 표피 증식에 미치는 영향을 검증하고자 하였다.

먼저 NHDF에 대한 AQE와 AQW의 세포독성을 평가하기 위해 WST-8 assay를 수행하여 48시간 세포 생존율이 AQE는 100㎍/㎖까지, AQW는 25㎍/㎖까지 처리했을 때 80% 이상 생존율을 유지하여 기초 독성이 낮음을 확인하였다.(Fig. 3). 따라서 이후의 세포실험에서 AQE는 100㎍/㎖까지, AQW는 25㎍/㎖까지의 농도를 사용하였다.

또한, TPA로 유도된 JB6 C141 세포 변형 모델에서 형태학적 변형을 억제하는지 평가하기 위해 soft agar assay를 수행하였을 때, colony 형성을 농도 의존적으로 억제하였다(Fig 4). 이는 木通 추출물이 피부세포의 비정상적인 증식 및 변형 과정을 효과적으로 차단할 수 있음을 시사하며, 건선에서의 각질형성세포 과증식 및 조직 비후 억제 기전과 연결된다²¹⁾. 특히 AQE 100㎍/㎖ 처리군에서 colony 형성 수는 TPA 단독군 대비 약 51.5% 이상 감소하였으며, AQW 25㎍/㎖ 처리군에서 45.0%가 감소하였다(Fig. 5). 이는 木通 추출물이 TPA-유도 세포 변형을 효과적으로 억제함을 의미한다.

대식세포주 RAW 264.7을 이용하여 木通 추출물의 IMQ(5㎍/㎖) 자극에 따른 염증성 사이토카인 분비 반응을 분석하였다. IMQ는 Toll-like receptor 7(TLR7) 을 자극하여 MyD88-의존성 NF-κB 및 MAPK 신호전달 경로를 활성화시키며, 이로 인해 TNF-α와 IL-6 같은 염증성 사이토카인이 급격히 분비된다²²⁾(Fig. 6). 본 연구에서 AQE(50㎍/㎖) 및 AQW(6.25㎍/㎖) 처리 시, IMQ-유도 TNF-α 및 IL-6 분비가 억제되었고, WST-8 분석 결과 85% 이상의 세포 생존율이 유지되어 비독성 범위 내 효과임이 입증되었다(Fig 7). 이러한 결과는 木通 추출물이 대식세포에서 염증성 사이토카인 생성을 억제함으로써 in vitro 수준에서 항염 반응 조절 가능성을 보여주며, 이러한 면역세포 수준의 효과는 in vivo에서 관찰된 피부 염증 완화 및 세포 증식 억제와 직접적으로 연결된다.

이어, IMQ-유도 건선 피부염 마우스 모델을 통해 木通 추출물의 피부 병변 완화 및 세포 증식 억제 효과를 평가하였다. 이 모델은 사람의 건선 병태와 유사한 표피 비후, 인설 형성, 홍반, 면역세포 침윤 등을 재현하는 대표적인 동물모델이다. 본 실험은 제모 후 4일부터 6일간 木通 추출물(AQE, AQW) 및 Clobetasol 0.05%는 아세톤에 용해하여 동일 부위에 200㎕씩 도포하였으며, 30분 후 Aldara 크림을 매일 1회 도포하였다(Fig. 8A). IMQ 처리 후 보였던 일시적인 체중 감소는 4일 차 이후 점진적으로 회복되었다(Fig. 8B). 이는 IMQ 유도 염증 반응에 따른 일시적 스트레스 반응으로 해석된다. 반면, 木通 추출물(AQE, AQW) 단일 처리군에서는 체중 감소가 없었다(Fig. 8B). 이는 木通 추출물의 처리 농도에서 전신 독성이 유발되지 않았음을 시사한다. AQE 및 AQW를 처리한 군은 IMQ 단독군에 비해 피부 병변이 완화되는 것이 관찰되었다(Fig 9, Fig 10). 또, PASI-like 점수가 유의하게 감소하였다(Fig 11). 이는 木通 추출물이 IMQ-유도 건선 피부염의 임상적 증상(피부 염증 반응, 과각화)을 효과적으로 억제함을 입증한다.

木通 추출물(AQE, AQW)이 IMQ로 유도된 건선 피부염 모델에서 피부의 조직학적 변화를 완화할 수 있는지 평가하기 위한 H&E 염색의 결과 표피 비후가 현저히 완화되었다. 이는 木通 추출물(AQE, AQW)이 IMQ로 유도된 피부 염증 반응과 각질형성세포의 비정상적 증식으로 인한 표피 비후화를 효과적으로 억제함을 의미한다. 따라서 木通 추출물은 피부 세포의 과도한 증식을 조절하고 염증성 미세환경을 완화함으로써, 건선 피부염의 병리적 진행을 완화하는 조직학적 보호 효과를 갖는 것으로 판단된다.

Ki-67은 세포의 증식 활성을 대표하는 지표로, 건선 피부에서 과도하게 활성화된 각질형성세포의 증식 정도를 평가하는 주요 생체표지자로 알려져 있다. 본 연구에서는 IMQ로 유도된 건선 피부염 마우스 모델에서 木通 추출물(AQE, AQW)이 각질 형성세포의 증식 억제에 미치는 영향을 확인하기 위해 Ki-67 면역조직화학 염색(Immunohistochemistry, IHC)을 실시한 결과 각질형성세포의 증식 억제가 확인되었으며, 이는 木通 추출물이 IMQ로 유도된 피부세포의 비정상적인 증식 경로를 조절함으로써 건선 피부 병변의 진행을 완화할 수 있음을 시사한다. 따라서 木通 추출물은 건선 피부염의 병태생리에서 중요한 역할을 하는 세포 증식 조절 인자로 작용할 가능성이 있다. 특히 AQW(12.5㎎/㎏)에서 가장 우수한 개선 효과가 나타났는데, 이는 수용성 성분군(예: glycosylated triterpenoid saponins)의 생체 이용률 또는 피부 침투 특성이 AQE와 차이를 보였을 가능성이 있다. 이는 木通 추출물의 효능 차이가 단순 농도 문제가 아닌 추출 용매에 따른 활성 성분군의 차이와 관련될 수 있음을 시사한다.

본 연구에서의 실험 결과를 종합하면, 木通 추출물은 NHDF에서는 80% 이상의 세포 생존율이 유지되어 안전성이 확인되었으며, JB6 C141 세포에서는 TPA-유도 세포 변형이 농도의존적으로 억제되어 세포 수준의 항증식 효과가 입증되었다. 또한, 대식세포주 RAW 264.7에서는 IMQ 자극에 의해 유도된 TNF-α 및 IL-6 분비가 유의하게 감소하여, 염증성 사이토카인 생성을 조절함을 확인하였다. IMQ-유도 건선 피부염 마우스 모델에서도 표피 비후가 유의하게 완화되었으며, Ki-67 면역조직화학 염색에서 각질형성세포의 과증식이 감소하였다. 이러한 결과는 木通 추출물이 비정상적인 피부세포 증식 경로를 조절하여 건선 병변의 진행을 완화할 가능성을 보여준다. 다만 본 연구는 건선의 핵심 면역 기전을 직접 규명하기보다는, IMQ 자극으로 유도되는 피부 염증 반응과 각질형성세포 증식 이상이라는 건선에서 관찰되는 주요 표현형에 대한 항염 및 항증식 효과를 평가하는 데 초점을 두었다.

본 연구는 다음과 같은 제한점을 가진다. 첫째, IL-23·IL-17A/F·IL-22 등 Th17 축의 핵심 사이토카인 측정이 이루어지지 않아, 木通 추출물이 Th17 면역반응을 직접적으로 조절하는지는 추가 연구가 필요하다. 둘째, AQE·AQW 간 성분 차이에 대한 정량 분석(LC-MS, HPLC 등)이 수행되지 않아, 활성 기여 성분의 비교가 충분히 이루어지지 못했다. 셋째, 표피세포 자체에 대한 직접적 기전 연구가 부족하므로, NF-κB·MAPK·STAT3·Nrf2 등의 분자 신호 경로 분석이 후속적으로 필요하다. 넷째, 본 연구에서는 木通 추출물을 외용제로 적용하여 평가하였으므로, 한약의 일반적인 투여 방식인 경구 투여 조건에서의 약물동태학적 및 전신적 효과는 본 연구 범위에 포함되지 않았다.

향후에는 木通 추출물 내 주요 활성 성분(예: hederagenin, akeboside D 등)을 분리·동정하고, 세포 증식 관련 신호 경로 및 IL-23/IL-17 면역축에 대한 작용 가능성을 추가적으로 규명할 필요가 있다. 또한, 3D human skin equivalent 모델 및 전임상 연구를 통해 피부 침투율, 국소 안정성, 약물동태학적 특성을 규명한다면, 木通 추출물의 항건선 소재로서의 실질적 응용 가능성을 더욱 구체화할 수 있을 것이다.

Ⅴ. 결 론