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Ⅰ. 서 론
소양감(가려움)은 피부를 긁거나 문지르고 싶은 충동을 일으키는 불쾌한 감각이며, 누구나 경험할 수 있는 흔한 증상이다1). 가려움은 다양한 피부과 질환, 전신적 질환, 정신적 질환 등에서 나타날 수 있는 가장 일반적이면서도 고통스러운 증상 중 하나이다2). 가려움증은 감각 자체로도 괴롭지만 가려워서 긁는 행위를 통해 피부 염증과 말초신경의 손상이 유발되고, 이는 가려움을 더욱 악화시킬 수 있기 때문에 이에 대한 적절한 조치가 필요하다1). 현재 서양의학에서 가려움을 완화하기 위해 여러 치료법이 적용되고 있으나 가려움의 병태생리는 알려져 있는 바가 제한적이기 때문에 치료법도 그 효능에 대한 충분한 근거 없이 경험적으로 사용되는 경우가 많다. 현재 표준 진료지침상 소양감을 호소하는 환자에게 일차적으로 1세대 혹은 2세대 항히스타민제를 처방하도록 권고되어 있다. 그러나 경구용 항히스타민제의 항소양효과에 대한 충분한 임상연구는 이루어지지 않았으며, 부작용도 상당수 보고되어 임산부나 소아에게는 일부 항히스타민제의 사용을 주의하도록 권고하고 있다3).
현재 가려움의 유발 기전에 대하여 많은 연구가 진행 중이나, 밝혀진 바는 제한적이다2,3). 따라서, 가려움의 다양하고 복잡한 유발 기전과 이에 영향을 미칠 수 있는 다양한 요인으로 인하여 단일 표적을 대상으로 하는 치료 전략은 예상했던 효과를 보이지 못할 가능성이 있다.
네트워크 약리학은 시스템 생물학을 기반으로 한 약리학적인 방법론으로 약물들은 대부분의 경우에서 다수의 표적에 작용한다는 개념을 기반으로 하고 있으며, 신약 발견의 새로운 패러다임으로 여겨지고 있다4). 네트워크 약리학의 포괄성, 체계성 및 전체론적 개념은 한약이 가지고 있는 다중 표적 및 다중 경로에 작용한다는 특성과 일치한다5). 대부분의 본초 및 한약의 효과는 경험적 지식에서 발전한 것으로, 이는 임상에서 다년간 유효성이 검증되었지만 과학적이고 합리적인 메커니즘 해석이 부족하다는 문제가 제기되고 있다. 이에 대하여 네트워크 약리학은 경험 기반 의학에서 근거 기반 의학으로의 변화를 이룰 수 있는 방안으로 볼 수 있다5).
枳實은 운향과(Rutaceae)에 속한 탱자나무(Poncirus trifoliata Rafinesque)의 익지 않은 열매로 약성은 쓰고 맵고 시고 약간 차다. 담을 없애고 적체된 것을 없애며, 기가 정체된 것을 깨뜨려 소통시키고 痞氣를 흩어서 통하게 하여 암, 염증 및 위장 장애에 다용되고 있다6). 枳實의 활성성분으로는 citral, hesperidin, linalool, limonene, neohesperidin, naringin poncirin 등이 있으며 이들 성분에 대하여 항암작용, 항알레르기작용, 항염증작용, 위장관 조절작용, 항산화작용 등이 보고되었다6).
또한 枳實은 in vitro 및 in vivo 연구에서 아토피성 피부염에 대하여 염증성 사이토카인의 생성을 억제하고, 각질층에서 필라그린의 발현을 회복시켰음이 보고되었다7). 이처럼 枳實은 가려움을 동반한 피부 염증에 대하여 효과가 있는 것으로 나타났지만 그 치료 기전은 완전히 설명되지 않았다. 따라서 본 연구에서는 네트워크 약리학을 활용하여 소양증을 동반하는 피부 염증에 대한 枳實의 잠재적인 목표 단백질 및 작용 메커니즘에 대해 탐색하고 해당 메커니즘과 연관 있는 유효 활성 성분을 밝혀 기존의 표준 약제를 보완하거나 대체할 수 있는 잠재력이 있는지 그 여부를 확인하고자 한다.
II. 연구 방법
枳實의 활성 화합물 중 유효한 성분을 선별하기 위하여 Traditional Chinese Medicine Integrated Database(TCMID)를 활용하였다. 검색어로 활용할 한약재의 명칭은 한국에서 활용하는 枳實인 탱자나무의 익지 않은 열매(Ponciri Fructus Immaturus)을 선정하였다6). 이후 TCMID에 검색하여 결과로 나타난 성분 중 경구생체이용률(oral bioavailability, OB)은 30% 이상, 약물유사도(drug likeness, DL)는 0.18 이상인 성분만을 선별하여 유효성분으로 간주하였다8,9). 스크리닝 후 Pubchem에서 화합물의 분자구조와 Smile number를 TCMID에서 제시된 분자구조와 비교하여 동일한지 여부를 확인하였다.
선별된 枳實의 유효 성분의 잠재적인 목표 단백질을 규명하기 위하여, Swiss Target Prediction database을 활용하였다. Pubchem에서 확인된 분자구조 및 표준 SMILE number를 검색하여 잠재적인 단백질 타겟을 얻었고, 실제로 유효 성분이 목표 단백질에 작용을 나타낼 probability가 0인 단백질은 잠재적인 목표 단백질이 아닌 것으로 보고 제외하였다10). 그 후 枳實의 유효성분과 그 표적 단백질 간의 네트워크를 Cytoscape 3.8.2를 통하여 네트워크를 시각화하였다.
소양증을 동반하는 피부 염증에 관여하는 것으로 알려진 단백질을 검색하기 위하여 Genecards database를 활용하였다. 검색에 사용한 검색식은 ‘Itch’ AND ‘Pruritus’ AND ‘Dermatitis’ AND ‘Eczema’로 구성하였다. Genecards는 multiple omics 및 기능 정보와 관련하여 homo sapiens 종에 대하여 알려져 있거나 예측된 유전자를 제공하는 복합 데이터베이스이다10).
유럽의 소양증에 대한 임상 진료 지침과2,3) 국내 소양증 치료에 대한 문헌1)을 기반하여 비교 대상으로 3세대 항히스타민제 중 fexofenadine을 선정하였다. 그 후에 Genecards에 fexofenadine을 검색하여 그 표적 단백질들을 수집하였다.
위 과정을 통하여 추출한 소양증을 동반한 피부 염증과 枳實, 그리고 fexofenadine이 작용할 것으로 알려진 단백질들 간의 관계를 알아보기 위하여 먼저 벤다이어그램을 활용하여 교집합이 되는 목표 단백질들을 얻었다11). 그 후 교차 단백질 표적들을 이용해 STRING database에서 목표 단백질들 간 상관관계를 분석하여 protein-protein interaction network(PPI network)를 구축하였다. 인간에 대한 작용 메커니즘을 연구하는 것이 목표이므로 Organism은 ‘Homo sapiens’로 설정하였고 상호작용 점수는 보다 높은 상관성을 보이는 메커니즘을 추출하고자 ‘highest confidence>0.700’로 설정하였다.
이후 MCODE plugin을 통해 앞서 구축했던 PPI network 에서 보다 긴밀하게 연결된 단백질의 조합을 확인하였다. MCODE의 설정값은 degree cutoff≥2, node score cutoff≥0.2, k-score≥2, maximum depth=100을 사용하였다12).
각 네트워크에서 핵심적으로 작용하는 단백질 표적들을 선별하기 위해 CytoNCA application을 통해 위상학적 분석을 실행하였다. Betweeness centrality(BC), Closeness centrality(CC), Degree centrality(DC), Eigenvector centrality(EC)의 네 가지 매개변수의 평균값을 구하고 평균값 이상을 갖는 Coregene을 추출하였다13). PPI 네트워크의 모듈은 단백질 복합체, 대사 경로 또는 신호 전달 시스템과 같은 특정 기능에 참여하는 단백질 그룹을 말한다. 이러한 모듈은 상대적으로 더 많은 edges를 갖는 node 그룹이거나 공통의 생물학적 기능을 공유하는 node 그룹이다. 이러한 node 그룹은 위상학적, 기능적 속성을 모두 갖는데 이를 찾아냄으로써 PPI 네트워크의 생물학적 메커니즘의 전반적인 이해를 도울 수 있다13).
枳實과 fexofenadine, 그리고 소양증을 동반한 피부 염증에 공통으로 관여하는 것으로 밝혀진 단백질들을 대상으로 작용 메커니즘 분석을 수행하기 위하여 Cytoscape 3.8.2 의 ClueGO plugin(version 2.5.8.)을 활용하였다. 이를 통해 Biological Process(BP), Immune system Process(IP), Cell Component (CC), 그리고 molecular Function(MF)에서의 Gene Ontology(GO) terms, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG) pathway을 검색하여 시각화하였다14). P-value≤0.05, Kappa value≥0.7인 메커니즘만 검색되도록 설정하여 작업을 수행하였다15).
그 후 같은 방법으로 fexofenadine과 소양증을 동반한 피부질환에 공통으로 관여하는 단백질들이 관여하는 메커니즘을 탐색한 뒤 枳實과 fexofenadine이 관여하는 메커니즘의 차이를 비교하였다.
III. 결 과
TCMID database를 통해 枳實(Ponciri Fructus Immaturus)의 잠재적 활성 화합물을 추출하였다. 이후 OB≥30%, DL≥0.18의 기준을 충족시키는 화합물을 선별하여 총 7가지의 활성 화합물이 추출되었다(Table 1). 선별한 枳實의 활성 성분에 대한 단백질 표적을 추출하여 202개의 단백질 표적을 수집하였다(Fig. 1, Appendix 1).
또한 소양증을 동반하는 염증성 피부질환에 관련된 표적 단백질을 찾기 위하여 Genecards를 사용하여 756개의 표적 단백질을 수집하였다. 그리고 유럽 및 국내 표준 진료지침에 근거하여 선정한 표준약제(fexofenadine)에 대하여 Genecards를 사용하여 75개의 표적 단백질을 수집하였다(Appendix 2, 3).
벤다이어그램을 통해 枳實(Poncirus fructus immaturus)의 유효성분들의 표적 단백질과 소양증을 동반하는 염증성 피부질환의 표적, 그리고 fexofenadine의 표적등 간 교차대상을 확인하였다(Fig. 2). 세 가지 군집의 교차대상은 4개로 ABCB1(ATP-binding cassette sub-family B member 1), CYP1A1 (Cytochrome P450 1A1), DNMT1(DNA-methyltransferase 1), MMP3(Stromelysin-1)이다. 枳實의 유효성분들의 표적과 소양증을 동반하는 피부염증의 표적의 교차 대상은 총 42개이며 fexofenadine의 표적과 소양증을 동반한 피부염증의 표적의 교차 대상은 31개이다.
벤다이어그램에서 확인된 枳實 혹은 fexofenadine과 소양증을 동반한 피부염증이 공유하는 표적 단백질들을 STRING database를 통하여 단백질들 간 상관관계를 분석하였다. 세 군집의 교차대상 4개에 대한 PPI 네트워크는 high confidence의 기준을 적용한 결과 edge가 발견되지 않았다. 소양증을 동반한 피부 염증에 대하여 枳實의 유효성분과 교차하는 42개의 표적에 대한 PPI 네트워크의 상호작용 edge는 90개, node는 42개이며 평균 node degree는 4.29로 나타났다(Fig. 3A). 소양증을 동반한 피부 염증에 대하여 fexofenadine과 교차하는 31개의 표적에 대한 PPI 네트워크의 상호작용 edge는 85개, node는 30개이며, 평균 node degree는 5.67로 나타났다(Fig. 3B).
또한 枳實과 가려움을 동반한 피부염증에서 공통으로 관여한다고 나타난 단백질들을 MCODE version 2.0.2를 통해 그들 중 보다 긴밀하게 연관되어 있는 묶음을 찾기 위한 추가적인 분석을 진행한 결과 총 2개의 group이 산출되었다(Fig. 4A, B).
Cluster 1(PIK3CG, AKT1, LCK, KIT, SRC, SYK, EGFR, AR, PIK3CA)의 경우 9개의 nodes, 27개의 edges를 가지고 있고, MCODE score는 6.75로 측정되었다(Table 2). Cluster 2(CYP1A1, CYP1B1, CYP1A2)의 경우 3개의 nodes, 3개의 edges를 가지고 있고, MCODE score는 3으로 측정되었다(Table 2).
| Cluster | Score (Density*#Nodes) | Nodes | Edges | Node IDs |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 6.75 | 9 | 27 | PIK3CG, AKT1, LCK, KIT, SRC, SYK, EGFR, AR, PIK3CA |
| 2 | 3 | 3 | 3 | CYP1A1, CYP1B1, CYP1A2 |
가려움을 동반한 피부염증에 연관된 gene protein과 枳實의 유효성분이 target으로 하는 gene protein 간 PPI 네트워크의 잠재적 표적 및 상호작용을 더욱 명확히 하기 위해 Corgene과 모듈을 추출하였다. CytoNCA를 통한 topology 분석 결과 枳實과 가려움을 동반한 피부염증 군집의 교차대상에 대한 PPI 네트워크 분석 결과 평균 BC, CC, DC, EC 값은 각 38.5789, 0.1246, 4.7368, 0.11762363이다. 이 네 가지 매개 변수의 평균값보다 높은 값을 가지는 Coregene은 총 12개이다(Table 3).
앞서 얻은 PPI network들을 cytoscrape 내 ClueGO version 2.5.9를 통해 그들이 인체 내에서 어떤 경로로 작용할 수 있는지를 알아보았다. 먼저 세 가지 군집의 교차 대상 4개에 대해 BP, MF, IP, CC, KEGG pathway에 대해 p-value<0.05에서 분석 시 의미 있는 결과를 얻지 못하였다. 가려움을 동반한 피부염증과 枳實이 공통적으로 가지는 protein을 대상으로 분석한 결과 83가지의 Functional group과 총 252개의 GO term을 얻었다. 이들 중 Coregene들만을 대상으로 다시 분석한 결과 11가지의 Functional group과 53개의 GO term을 얻었다. Coregene들이 주로 관여하는 생체내 경로는 ‘Nitric-oxide synthase regulator activity’, ‘Epidermal growth factor receptor signaling pathway’ 등이 포함되었다(Fig. 5A).
MCODE 분석을 통해 얻어진 두 그룹을 대상으로 분석을 시행한 결과, cluster 1 에서는 13개의 Functional groups와 55개의 GO terms를 얻었다. 이중 KEGG pathway는 5개, CC는 3개, BP는 47개였으며, MF, IP에 대한 결과는 없었다. Cluster 1에 포함된 목표 단백질들이 관여하는 생체내 경로는 ‘Fc receptor signaling pathway’, ‘Central carbon metabolism in cancer’, ‘phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K) complex, class 1B’ 등이 포함되었다(Fig. 5B). Cluster 2의 경우, 2개의 Functional groups와 7개의 GO terms와 연관이 있었으며, 그 중 KEGG pathway는 1개, BP는 6개 포함되었다. 이들이 관여하는 생체내 경로는 ‘omega-hydroxylase P450 pathway’와 ‘Xenobiotic catabolic process’가 포함되었다(Fig. 5C).
마지막으로 枳實과 fexofenadine이 작용하는 coregenes를 대상으로 각각이 관여하는 GO terms & KEGG pathway를 분석하여 비교하였다(Fig. 5D). 枳實이 주로 관여하는 생체 내 경로는 ‘Estrogen signaling pathway’, ‘Transription coregulator activity’ 등으로 나타났고, fexofenadine이 주로 관여하는 생체 내 경로는 ‘Inflammatory bowel syndrome’, ‘Asthma’ 등으로 나타났다.
IV. 고 찰
가려움은 가장 흔한 증상 중 하나이지만 치료가 어렵고 재발이 잦은 특징을 가진다. 또한 가려움의 양상은 따끔함이나 화끈거림으로 나타나기도 하며 참을 수 없을 정도로 심한 경우도 있어 환자들의 일상생활에 중대한 영향을 미치며 심신을 쇠약하게 만들 수 있다16). 그렇기 때문에 가려움증의 효과적인 치료법의 확립은 필수적이나, 현재 가려움증에 주된 치료 약제로 선택되는 경구 항히스타민제는 효과가 단기적이며 두드러기 등 일부 질환을 제외하고는 그 효과에 대한 근거도 부족한 실정이다3). 이와 같이 현재까지도 이에 대한 표준화된 치료법이 없으며 항소양제에 대한 연구도 아직 부족하기 때문에 임상 진료 가이드라인의 많은 부분이 사례 연구나 전문가의 의견을 기반으로 한다. 그러므로 만성 소양증을 호소하는 염증성 피부질환은 병태생리에 초점을 맞춘 새로운 치료법이 필요하며 다인적인 특성에 따라 다중 표적을 갖는 한의학이 효과적인 솔루션이 될 수 있다17).
가려움 자극은 표피 및 표피와 진피의 경계 부위에서 발생하여 비수초성 C 신경섬유로 전달된다. 명확히 밝혀지진 않았지만 소양증을 일으키는 신경경로로는 히스타민 감수성 및 비히스타민 감수성 말초 C 신경섬유에 따른 신호 전달이 관여한다. 소양감을 전달하는 일차 구심성 C 신경섬유는 이차 전달 뉴런과 시냅스를 형성하고 척추의 dorsal horn을 지나 반대측 척수 시상 경로를 경유하여 시상으로 올라간다. 그 후 소양증은 대뇌피질로 전달되어 긁고자 하는 욕구가 발생된다1). 또한 사이토카인, 프로테아제 및 신경펩타이드의 방출 증가와 함께 T 세포, 비만세포, 호중구, 호산구, 각질형성세포 및 신경세포 사이의 복잡한 상호작용이 소양감을 악화시킨다. 이러한 경로를 방해하는 것은 비정상적인 소양증 인식을 유발할 수 있다. 따라서 이에 대한 모든 구성 요소를 소양증의 잠재적 치료 표적으로 삼을 수 있다.
본 연구에서 枳實의 구성 성분 중 인체 내에서 유효하게 작용할 것으로 생각되는 성분들을 선택하였는데, 이 중 가려움 및 염증에 대하여 유효하다는 연구결과가 있는 성분들이 존재하였다. Sinensetin의 경우 NF-kB 매개 염증 유발 경로에 작용하여 IL-6, TNF-alpha, NO, COX-2, PGE2의 발현과정을 억제하여 염증을 억제한다는 효과가 있다는 것이 보고된 바 있다18). 5,7,4'-Trimethoxyflavone에 대해서도 복수의 연구에서 항콜린, lipolytic, 신경보호, 항염 효과가 있다는 것이 발표되었다.
세포연구에서 5,7,4'-trimethoxyflavone는 지질의 축적을 억제하며 성숙한 지방세포의 증식을 감소시키는 작용이 있다는 결과가 보고되었다19). NO에 대한 작용도 보고되었는데, 동물세포를 대상으로 한 연구에서 체내 iNOS의 발현을 조절하여 NO의 생성을 줄이는 효과가 있음이 보고된 바 있다20). 이를 통해 枳實이 소양감을 동반한 피부 염증에서 다양한 염증 신호전달 과정 및 염증 세포에 관여하여 항염증 및 신경보호 효과를 나타낼 것임을 알 수 있다.
枳實의 활성성분을 분석하여 각 성분이 작용하는 단백질을 추출한 후, 그 중 보다 높은 정도로 관여할 것으로 예상되는 coregene을 선별한 결과 NOS2, MMP9, AhR, EGFR, PIK3CA, AKT1, PTGS2, SRC, KIT 등이 coregene으로 작용하고 있는 것으로 나타났다. NOS2 는 NO를 만들어내는 효소로, 생성된 NO는 TLR의 susceptibility를 증가시켜 대식세포를 활성화시킨다. 또한 활성화된 대식세포나 소교세포(microglial cell)들은 NOS2의 발현을 증가시켜 염증을 가속화시킨다21). 또한 표피의 염증상황에서 IL-13에 의해 활성화된 각질세포에서 MMP9가 높은 정도로 활성화되어 있고, MMP9는 대식세포의 이동에 관여하므로 NOS와 MMP9는 대식세포 활성으로 이어진 피부 염증에 관여한다고 생각할 수 있다. NO에 의한 활성산소의 활성화는 신경계 질환에 중대한 영향을 미치는 NO 스트레스의 유도에 의해 세포 손상을 일으킬 수 있고, glutamate 매개 흥분독성에 기여하고, 신경계에서는 수초 및 신경조직 파괴와 같은 NO 스트레스 장애를 촉진하며, 중추신경계뿐만 아니라 말초신경계에서도 활동전위 전달의 차단을 유도하여 신경장애를 유발한다22). AhR(Aryl hydrocarbon receptor)는 SRC, EGFR, MAPK등과 상호작용하여 피부장벽기능 유지에 관여하는데, AhR/ARNT 신호전달 과정을 통해 filagrin 및 loricin의 표현을 증가시켜 각질세포의 분화를 촉진한다. 또한 AhR에 의한 신호전달 경로는 랑게르한스 세포의 성숙 및 항원에 대한 면역작용에 필수적인 것으로 알려져있다. 더욱이, Th17 세포에서도 높은 수준의 AhR 발현이 나타나며 이러한 림프구에서 IL-22 분비 또한 AhR 활성에 영향을 받기 때문에 피부장벽기능 유지 및 면역반응에 AhR이 관여하고 있음을 알 수 있다23). 또한 EGFR, PIK3CA, AKT1, PTGS2, SRC은 모두 세포 내 신호전달에 관여하는 단백질들이며, COX-2 대사에 관여하여 염증을 유발하는 과정에 관여하는 것이 알려져 있고24), PPAR과 함께 세포증식작용에도 관여하는 것이 알려져 있으므로 간접적으로 피부장벽 기능 및 염증발생에 관여하는 것으로 생각된다25). 또한 KIT는 Tyrosine protein kinase로서 PI3K/AKT, SRC경로를 활성화시키고, STAT1, STAT3, STAT5A, STAT5B, RAS, RAF, MAPK/ERK 등 다양한 단백질들의 발현을 유도하여 cytokine ligand의 활성화, stem cell factor의 활성화를 통해 다양한 세포들의 증식, 분화, 이동 및 자멸사 과정에 중요한 역할을 담당하여 조혈, 줄기세포분화, 멜라닌세포생성, 비만세포 분화, 이동 및 기능에 관여함이 알려져 있다26). 이상의 coregene들의 생체 내 기능으로 미루어 볼 때, 枳實을 가려움을 동반한 염증에 사용할 경우 표피의 각질세포, 랑게르한스 세포 및 대식세포의 발현을 조절하여 염증의 발생 및 확산을 억제하는 한편, NO와 COX-2의 염증신호전달과정에 관여하여 염증유발 물질이 발현되지 못하도록 함으로써 표피의 염증 억제효과가 나타나고, 이를 통해 가려움을 억제할 것으로 기대할 수 있다.
枳實과 가려움을 동반한 피부 염증에 모두 관여하는 단백질 중 coregene으로 선별된 목록을 대상으로 GO 및 KEGG pathway 분석한 결과 ‘Nitric oxide synthase regulator activity’, ‘Epidermal growth factor receptor signaling pathway’가 주로 연관되어 있는 것으로 나타났다. Nitric Oxide는 신경전달물질 그리고 신경조절제로서의 기능을 하는 분자로, 일부 가려움증 피부 질환 및 가려움증에서 NO의 역할이 명확해지고 있다. In vitro 연구의 경우 아토피 피부염의 쥐 모델에서 NO가 substance P 및 serotonin 유도 가려움증을 향상시킨다는 것이 보고된 바 있으며27), 임상적으로도 아토피 피부염 및 건선과 같은 소양증 피부 질환 환자의 경우 피부 및 혈청 NO의 농도가 증가하는 것으로 나타났으며, 피부의 NO 발현을 억제하는 약제를 투여하는 경우 가려움증이 완화되는 경향을 보였다28). 또한 NO는 신경성 염증에도 기여하는 것으로 알려져 있는데, 가려움 수용체에서 받은 신호를 전달하는 채널 중 하나인 TRPV1이 활성화되어 Ca2+ 유입이 일어날 때 내피 세포 및 평활근 세포에서 산화질소(NO)를 방출시켜 혈관 확장을 유도한다는 것이 보고된 바 있다29). Epidermal growth factor receptor(EGFR) 또한 다양한 피부 질환에서 관찰되는 표피 위축, 증식 및 비정상적인 분화와 연관이 있음이 알려져 있으며30), EGFR inhibitor를 적용했을 경우 각질세포 성장 및 장벽기능에 긍정적인 영향을 미쳤다는 것이 보고된 바 있다31). 피부 장벽 기능이 불완전할 경우 신경성 염증 및 가려움의 발생이 밀접한 연관이 있음을 고려할 때, 枳實의 가려움에 대한 억제효과는 손상된 피부장벽기능을 정상화시킴으로써 얻어지게 되는 것임을 추측해볼 수 있다.
본 연구에서는 枳實과 소양감을 동반한 피부염증에 모두 관여하는 단백질들을 Mcode plugin을 통해 다시 그들 간의 관계에 따라 두 개의 cluster로 나누어 분석해보았다. Cluster 1에 포함된 단백질들이 관여하는 것으로 나타난 경로는 ‘Fc receptor signaling pathway’, ‘Central carbon metabolism in cancer’, ‘Phosphatidylinositol 3-kinase complex, class IB’인 것으로 나타났다. Fc receptor(FCR)는 항원이 아닌 항체의 Fc 부분을 인식하는 수용체로, 많은 FcR은 B cell receptor 및 T cell receptor와 활성화 경로를 공유하며 적절한 조건에서 항원 수용체와 동일한 전달 경로를 사용하여 세포 반응을 유도한다. FcR은 모든 종류의 항체에 대하여 존재하는데, 최근 Fc receptor가 피부 염증 및 가려움 유발에 관여할 수 있다는 연구보고가 나오고 있으며, in vitro 및 in vivo 연구에 따르면 삼차신경의 일부인 통각수용성 뉴런에서 발현된 FceRI가 IgE에 의해 직접 활성화되고 알레르기성 안구 가려움증에 기여할 수 있음을 보고한 바 있다32). 해당 연구에서 쥐에게 항원을 처리하여 유발된 긁기 반응은 비만 세포 안정제 또는 히스타민 I 수용체 길항제의 처리 후에는 부분적으로만 완화된 반면 FceRIa에 대한 차단 항체의 국소 적용으로 크게 완화되었다32). 다른 한편 Fc gamma receptor를 통한 억제성 신호는 IgG를 매개로 하여 발생하는 음식물 관련 알레르기 반응을 차단한다. 비만세포와 호염구들은 음식물 알레르기 관련 제 2형 면역반응의 부수적인 중요한 기능을 담당하는데, Fc gamma receptor를 통해서 전달되는 IgG를 통한 억제성 신호는 비만세포와 호염구의 활성을 억제한다33). IgM에도 fc receptor가 존재하는데, B cell 의 성숙과 분화, 활성화를 조절하고 B cell이 생존을 유지할 수 있도록 하는데 관여한다. 항원이 도달했을 때는 체액성 면역의 일부로서 B cell을 활성화시켜 IgM을 분비하도록 하고, 자가항체가 접촉 시 fc mu receptor가 BCR과 상호작용하여 해당 B cell을 자멸사 혹은 면역성결핍 상태로 유도하여 B cell의 관용형성에도 기여한다는 것이 보고되었다34).
중심탄소대사(central carbon metabolism)는 T 세포가 여러 생체 내 대사에 관여할 수 있는 에너지, 산화/환원력을 제공하고 세포의 항상성을 유지시켜주는 경로로 T세포의 활성 및 유지에 필요한 대사 중 하나이다35). 피부 가려움증에 대한 중심탄소대사의 작용에 대한 연구는 없으나 T cell의 활성에 기여함으로써 간접적으로 피부 염증 및 가려움 억제에 기여할 것으로 생각된다.
Phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K)는 증식, 접착, 생존 및 운동성을 비롯한 다양한 세포 과정을 조절하는 지질 인산화효소이며 본래 암과 관련이 깊다고 알려졌으나 최근 PI3K와 피부 병변에 대한 연구가 다수 진행되고 있다. 피부에서 PI3K/AKT/mTOR 경로의 조절장애는 피부암, 건선 및 아토피 피부염(AD)을 포함하여 제어되지 않는 증식을 특징으로 하는 여러 병리학적 상태에 기여하며36), 당뇨병성 상처모델에서 PI3K/Akt 경로의 활성이 저산소 상태에의 저항력을 높이고 상처치유를 촉진할 수 있음이 보고되었다37).
Cluster 2에 포함된 단백질들이 관여하는 것으로 나타난 경로는 ‘Omega hydroxylase p450 pathway’, ‘Xenobiotic catabolic process’인 것으로 나타났는데, omega hydroxylase p450 경로는 표피 지질을 구성하는 필수적인 성분 중 하나인 acylceramide의 생산에 필수적인 요소로 작용하여 표피투과장벽 형성에 중요한 역할을 수행한다38).
이를 통해 枳實이 가려움을 동반한 피부 염증을 개선하는 주된 작용 기전은 표피장벽의 각질증식 및 분화 조절, 각질세포간 지질 형성을 통한 표피투과장벽기능 정상화, 랑게르한스 세포, 대식세포, 비만세포 뿐만 아니라 T세포, B 세포 등 체내 면역반응을 담당하는 세포들의 과활성 저하를 유도하고 NO에 의한 염증세포 활성이나 신경성 염증을 억제하는 것으로 볼 수 있다.
본 연구에서는 한약재로 枳實을 선택하고, 가려움을 동반한 염증에 대한 표준약제로 fexofenadine을 선정하여 두 가지 약의 coregene이 각각 관여하는 생체 내 경로를 비교하였다. 枳實의 coregene 분석 결과 에스트로겐 신호 전달경로, 전사 공조절자 접합경로 등과 연관되어 있었고, fexofenadine의 coregene 분석 결과 염증성 장 질환 등과 연관되어 있었다. 에스트로겐 신호전달경로는 표피 지질 형성을 통하여 피부투과장벽 형성에 기여하는 경로이며, 염증세포의 활성을 조절하여 피부염증에도 관여하는 것으로 알려져 있다39). 전사 공조절자(transcription coregulator) 또한 저산소 상태, shear stress, cytokine, chemokine, Growth factor에 의해 자극을 받으면 하위 신호전달 연쇄반응을 통해 세포증식을 촉진하고 전염증성 반응을 유발한다는 것이 알려져 있다40). 이것과 비교하여 fexofenadine의 coregene 분석 결과 염증성 장질환, 천식 등의 병리와 연관되어 있음을 확인할 수 있었다. 요약하면, fexofenadine은 항원-항체반응 또는 알레르기 반응에 직접적으로 작용하고, 枳實은 피부장벽의 기능을 유지하면서 염증세포의 활성을 억제하여 쉽게 염증이 발생하지 않도록 조절하는 부분에 작용하는 양상으로 치료 기전의 방향성이 달라진다. 그러나 두 가지 방향의 치료 기전은 서로 관련있는 부분이 많으므로 枳實과 fexofenadine을 함께 적용했을 때 가려움 및 피부 염증을 억제하는데 시너지효과를 낼 수 있을 것으로 생각한다.
본 연구에는 분명한 한계점이 존재한다. 단일 약재를 대상으로 분석한 결과를 바탕으로 하였기 때문에, 다수의 약재가 복합된 처방으로 작용했을 경우에 다른 약재들과 어떤 상호작용이 있을지에 대한 것은 불분명하다. 또한 본 연구의 결과는 세포 혹은 동물 수준의 실험을 통해 검증되지 않았으므로 추후 이에 대한 실험 연구가 추가적으로 필요할 것이다.
V. 결 론
본 연구는 네트워크 약리학을 기반으로 하여 소양증을 동반한 피부 염증에 대한 枳實의 잠재적인 활성 성분과 관여되는 그 표적들을 탐색하고 그들이 연관된 생체 내 메커니즘을 분석한 후, 피부 가려움 및 염증과의 연관성을 확인하였다. 枳實의 주요 활성 성분과 잠재적 표적들의 네트워크가 구성되었으며 이들이 소양증을 동반한 피부 염증에서 표피투과장벽기능 정상화, 체내 면역반응을 담당하는 세포들의 과활성 저하 및 NO에 의한 염증세포 활성이나 신경성 염증을 억제하는 효과가 있을 가능성을 확인하였다. 이를 통해 枳實이 소양증을 동반하는 피부 염증에 대해 직접적, 간접적으로 항소양 효과를 나타낼 수 있을 것으로 기대되며, 피부장벽기능이 정상적이지 않은 병리적 상황에도 활용할 수 있을 가능성을 확인하였다. 또한 표준 약제인 fexofenadine과의 비교를 통하여 병용 시 서로의 효능을 보완하여 시너지효과를 낼 수 있을 가능성을 확인하여 소양증을 동반하는 염증성 피부질환에 긍정적 효과를 보일 것으로 예측한다. 또한 기존의 枳實에 대한 항소양 연구 경향을 벗어나 새로운 연구 방향을 제시했다는 데 의미가 있다.
