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Ⅰ. 서 론
사람의 피부노화는 크게 자연노화와 광노화 두 과정이 있다. 자연노화는 연령의 증가에 따라 나타나며, 광노화는 자외선에 대한 노출의 결과로 발생한다. 표피에서는 각종 오염물, 자외선, 화학물질 등에 의해 세포가 손상된다. 진피의 경우 엘라스틴의 파괴와 히아루론산의 감소로 콜라겐과 뮤코 다당류가 물과 결합하는 능력을 잃게 되고 그 결과 탄력이 줄어들고, 주름이 생기게 된다1).
해송자(海松子)는 소나무과(Pinaceae) 잣나무(Pinus koraiensis Siebold et Zuccarini)의 씨앗으로, 잣, 홍송(紅松), 송자인(松子仁) 이라고도 한다2). 우리나라, 만주, 흑룡강 유역, 일본 등에 분포하며, 종자는 일그러진 삼각형이나 난형으로서 암자갈색을 띄며 종피를 갖고 있다. 일반성분 조성을 보면 지방질이 70%, 단백질이 15%, 탄수화물이 5%, 회분이 3% 수준으로서 지방질을 다량 함유하고 있다3).
해송자는 한의학 고전에서 치료용 사용례로 제시된 고전은 《鄕藥集成方》4)으로 “味甘, 小溫, 無毒”이라 하며 주치로써 “主骨節風, 頭眩, 去死肌, 髮白, 散水氣, 潤五臟, 不飢”로 관절염, 어지럼증을 치료하고, 죽은 살을 없애고, 머리털이 흰 것을 변하게 하고, 물기를 흩고, 인체 장부의 기능을 활성화 하고, 허기지지 않게 한다고 하였다. 《本草綱目》5)에서도 해송자는 위의 치료효과와 더불어 “潤皮膚 肥五臟 主諸風溫腸胃 久服輕身延年不老”이라 하여 피부를 윤기나게 하며, 오장육부의 기능을 충실하게 하며, 여러 가지 풍병을 치료하고, 오래 복용하면 몸이 가벼워지고 수명이 늘어나고 늙지 않는다고 하였다. 상기된 주치 효과 중 去死肌와 潤皮膚의 경우 현대의 피부 노화에 대한 항노화 효과로 볼 수 있다.
잣나무에 대한 기존 연구 중 해송자유(海松子油)에 대한 것은 주로 지질 대사와 관련된 것이다6,7). 그 외에 잣나무의 잎, 껍질, 송이 등 해송자유 이외의 부분의 성분, 생리활성 물질, 미백효과, 주름 개선, 항산화 활성, 항균 활성, 항염증 효과에 대한 연구가 되어져 있다8-10). 이렇듯 해송자유보다는 잣나무의 잎, 껍질, 송이 등 다른 부위에 대한 연구가 활발한 것은 한의학 고전에서 해송자유의 사용례가 적었던 것에 기인한 것으로 생각된다.
초임계유체 기술은 고용해력, 빠른 물질 이동과 열 이동, 미세공속으로 빠른 침투성 등을 이용한 기술로서 기술적 환경적 단점을 보완 및 개선할 수 있는 기술로 주목받고 있다11). 기존 연구의 해송자 추출의 압착이나 유기용매를 활용한 추출법과 비교하여 초임계유체 추출법은 높은 효율성과 선택성 및 짧은 추출 시간 등의 이점 때문에 주목 받고 있는 방법이다. 또한 해송자유에 대한 기존 연구 중 이 방법을 채택한 연구는 없었으며 본 연구에서 항산화 및 인체 적용 시험을 통하여 유의미한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
Ⅱ. 재료 및 방법
초임계 이산화탄소추출은 2L추출기를 사용하여 추출하였다(Fig. 1). 파쇄한 해송자를 추출기에 넣고 예열 장치를 지나 가열되어 추출기 안으로 들어간다. 이때 초임계 상태가 된 이산화탄소는 해송자와 접촉하여 내부의 비극성 물질인 해송자유를 추출하게 된다. 초임계이산화탄소에 용해된 해송자유와 초임계이산화탄소는 back pressure regulator를 통하여 압력이 낮아지고 분리기 안에서 이산화탄소가 기체가 되어 추출물은 분리기 밑으로 모아지게 된다. 기체가 된 이산화탄소는 냉각기를 통하여 액화되고 recycle tank 안으로 들어가 펌프를 통하여 다시 추출기 안으로 들어가게 되도록 이산화탄소 재 사용 시스템을 사용하였다. 분리기 안의 해송자유는 10분마다 한 번씩 진행하여 추출물을 얻었다12,13).
Gas chromatography(GC)를 이용하여 해송자유의 지방산을 분석하였다. 분석 장비로는 Agilent GC-FID (Agilent, 7890B, CA)를 사용하였고, 지방산 표준 물질은 총 37종을 사용하였다. 사용된 표준 물질은 아래 표에 나타내었다(Table 1). 분석에 쓰인 column은 supelco SP-2560 capillary column(100m, 0.25㎜(I.D), 0.25㎛)을 사용하였다.
Beta carotene bleaching assay(BCB)는 alpha-tocopherol 0.1%와 비교 하였다. Beta-carotene을 chloroform에 녹여 linoleic acid, PEG-40와 혼합한 뒤 감압증류방법으로 chloroform을 완전히 제거하였다. 이후 물과 함께 유화시켜 해송자유와 3시간 반응하여 490㎚에서 흡광도를 측정하였다.
항노화 효능을 확인하고자 proteome 분석을 실시하였다. 분석에 사용된 cell은 human dermal fibroblasts cell을 사용하였으며 해송자유를 dimethylsulfoxide에 용해시킨 후 cells에 2.5㎕씩 첨가하여 37°C, 5% 이산화탄소에서 배양하였다. 24시간 배양 후 cells pellet을 얻고 Dulbecco’s phosphate buffer saline으로 washing 하였다. Cell pellet에 lysis buffer를 넣고 30°C에서 5시간 incubation 하여 단백질을 추출하였고 상등액을 얻은 후 단백질을 정량하였다. 일차 전기영동은 immobilized pH gradient (IPG) strip에 rehydration solution (urea, thiourea, CHAPS, DTT, Glycerol, DDW, bromo-phenol blue, 2% pharmalyte)을 첨가하여 빛이 차단된 조건에서 12시간 동안 rehydration 시킨 뒤 Ettan IPGphor3(GE healthcare, USA)에 strip을 올려놓은 후 cup loading 방식으로 100㎍ 단백질, DNase, pI marker를 loading 한 후 미네랄 오일을 첨가하였다. 일차 전기영동은 순서대로 500V 로 750Vhr, 1,000V 로 800Vhr, 10,000V로 18,000Vhr, 10,000V로 110,000Vhr 하였다. 이차 전기영동은 일차 전기영동이 끝난 IPG strip을 strip tray에 올려놓은 후 1% DTT가 포함된 equilibration solution을 넣어주고 equilibration 한 뒤 DTT 용액을 제거하고 iodoacetamide solution을 넣고 15분 기다린 후 iodoacetamide solution을 제거하였다. Ettan DAIXsix electrophoresis unit (GE healthcare, USA)에 SDS buffer (Tris, Glycine, SDS, DDW)를 넣어 주고 4°C를 유지하면서 순환시켜 주고 SDS gel 위에 IPG strip 을 올려놓은 후 agarose solution을 넣어 SDS gel 과 IPG strip 을 고정시켜준 후 전압을 걸어 전기영동을 시작하였으며 순서대로 10㎃로 1시간 단백질을 정렬, 40㎃ 4시간 단백질을 분리하였다. 2차 전기영동까지 끝난 gel은 silver nitrate staining을 통해 염색하여 분석하였다.
본 인체 적용시험 연구는 시험 기관의 임상시험 심사위원회(IRB)의 승인과 헬싱키 선언, 임상시험 관리 기준 등 관련 규정을 준수하여 실시되었고, 시험의 목적 및 화장품의 특성을 인체 적용 시험 대상자에게 설명서를 통하여 설명하였으며, 시험을 통한 위험성 및 목적 등을 알고 서면으로 동의한 자원자만이 참여하였다. 시험 기간 동안 이상 반응은 발생하지 않았다.
본 인체 적용 시험은 피부 상태 진단에 따라 평균 연령 42.9±3.6세인 20명의 건강한 성인 여성 시험 대상자를 선정하여 실시하였으며 참여한 시험 대상자 20명이 중도 탈락 없이 최종 시험을 완료하였다. 인체 적용 시험 참여에 동의한 시험 대상자는 동의한 순서대로 스크리닝 번호를 부여받고, 7일 이내에 스크리닝 검사를 실시하였다. 스크리닝 결과 선정 기준과 제외 기준에 모두 적합한 경우, 대상자에게 시료를 배정 하였으며, 선정 기준과 제외 기준은 다음과 같다.
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① 선정 기준
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② 제외 기준
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a. 임신 또는 수유 중인 여성과 임신 가능성이 있는 여성
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b. 피부 질환의 치료를 위해 스테로이드가 함유된 피부 외형제를 1개월 이상 사용한 자
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c. 동일한 시험에 참가한 뒤 3개월이 경과되지 않은 자
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d. 민감성, 과민성 피부를 가진 자
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e. 시험 부위에 점, 여드름, 홍반, 모세혈관 확장 등의 피부 이상 소견이 있는 자
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f. 시험 시작 전 3개월 내에 시험 부위에 동일 또는 유사한 화장품 또는 의약품을 사용한 자
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g. 현저한 영양 장애자
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h. 시험 시작 전 3개월 내에 피부 관련 시술 또는 피부 관리를 받은 자
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i. 그 외 주 시험자의 판단으로 시험에 부적합하다고 생각되는 자
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스크리닝 시 사용 중인 기능성 화장품 포함 미용기기 및 피부 관리기 사용을 제한하였으며, 인체 적용 시험기간 동안 주름 개선 기능성 화장품(레티노이드제, AHA 등) 등을 사용하지 않도록 가이드 하였다. 배정받은 시험 참여자는 기저 방문 이후 시험 시료를 아침, 저녁 2회 시험 부위인 눈가에 고르게 도포하였으며 순응 일지를 통하여 시험 참여자의 도포를 확인 하였다.
시험 부위는 대상자의 안면(눈가) 부위에 해송자 오일을 적용하였으며 방문1(0주, 시험 시작 전), 방문2(2주 후), 방문3(4주 후) PRIMOSCR(광학 3차원 피부 영상 측정기 CANFIELD, NJ)를 사용하여 기기 평가를 진행하였으며 PRIMOSCR을 통하여 방문 1, 2, 3회 차의 기저 대비 눈가 주름을 측정하였으며, 주름의 평가에는 Ra, Rq, Rmax의 측정변수를 사용하여 평가 하였고, 측정 변수 설정은 식품의약품 안전처의 피부의 주름 개선에 도움을 주는 기능성 화장품 유효성 평가 가이드라인을 기준으로 설정하였고 측정 변수에 대한 통계는 기저 대비 모수적 방법인 paired t-test와 비 모수적인 방법인 wilcoxon signed rank test를 이용하였으며, 통계 결과는 유의차 5% (p<0.05) 일때 통계적 유의성이 있다고 판단하였다. 눈가 주름 개선율은 아래 식에 따라 계산하였다. 본 인체 적용 시험은 안전성 유효성 평가 전문기관인 충청북도 화장품 임상 지원 센터에서 실시하였다.
Ⅲ. 결 과
해송자의 추출 조건은 350 bar 60°C였으며 170분간 추출하였고 총 추출량은 68% 추출되었다. 10분마다 추출한 누적 kinetic graph는 다음과 같다(Fig. 2).
해송자유는 GC를 이용하여 37종 중 10종의 지방산을 분석하였다. Oleic acid가 49.7%의 가장 많은 조성을 보였고 linoelic acid가 두 번째로 많은 34.1%로 분석되었다. Oleic acid를 다량으로 함유하고 있는 천연 오일은 항산화 효과가 있다는 연구는 많이 보고되어졌다14,15).Linoelic acid는 오메가-6 지방산으로 음식물로 섭취해야하는 필수 지방산 중의 하나이며. 리놀렌 산 지질 라디칼을 사용하면 페놀류의 항산화 효과를 나타낼 수 있으며16), 쥐에서 linoelic acid의 부족이 일어나면 피부 벗겨짐, 탈모 유발을 나타내는 것을 보였다17). 지방산 분석의 chromatogram은 아래 그림에, 조성은 아래의 표에 나타냈다(Fig. 3, Table 2).
해송자유의 BCB assay에서는 alpha-tocopherol 0.1% 대비 오일만 사용하였을 때 약 125% 의 항산화 효과를 보여주었다(Fig. 4). 항산화의 메커니즘은 매우 다양하게 작용하기 때문에 어떠한 단백질이 작용하여 항산화 효과를 나타내었는지는 2D PAGE를 활용하여 proteom 분석을 통하여 확인하였다.
Control gel 에서 1,353개의 단백질 spot이 검출되었고 해송자유를 처리한 cell의 gel에서는 1,191개의 단백질 spot이 검출되었다. 두 gel에서 매칭된 단백질은 모두 413개, 증가된 것은 230개 감소된 것은 183개로 나타내었다. 아래 그림에 두 gel의 사진을 나타내었고, 이하 표에서 매칭된 단백질의 감소 및 증가된 수치를 나타내었다(Fig. 5, Table 3). 5가지 메커니즘 상의 단백질이 모두 변화된 것을 확인하였다.
콜라겐 합성 경로에 있는 6가지 단백질이 모두 증가되었으며, P3H3에서 370% 가량 증가되는 것을 볼 수 있었다. Prolyl 3-hydroxlase3(P3H3)은 mRNA가 폴리펩타이드로 번역된 후 하이드록실화를 촉매하는 역할 로 콜라겐 합성에 도움이 된다18). MMP-1과 12 모두 감소하였고 세포외 매트릭스 및 생체 역학적 리모델링에 중요한 역할을 하는 Integrin B5,7 이 증가됨을 볼 수 있었다. Cytikines에 속하는 세 가지 단백질이 감소되는 것을 확인하였으며 항산화 효소인 catalase, GRM 또한 증가됨을 확인하였다. Superoxide dismutase에 의해 분해된 과산화수소를 산소와 물로 분해시키는 효소인 catalase도 300% 이상 증가됨을 확인하였다.
눈가 주름을 분석한 결과 해송자유를 사용하기 전과 비교하여 사용 2주 후에는 변수 Rmax에서만 통계적으로 유의차 있게 나타났으나, 4주 후에서는 변수 Ra, Rq, Rmax 모두 통계적으로 유의차 있게 나타났다(p<0.05). 또한, 해송자유를 사용하기 전과 비교하여 변 수 Ra에서 사용 2주 후 1.4%, 사용 4주 후 4.4%의 눈가 주름 개선 효과를 나타내었고, 변수 Rq에서 사용 2주 후 1.2%, 사용 4주 후 4.4%의 주름 개선 효과를 나타내었으며 변수 Rmax에서 사용 2주 후 1.8%, 사용 4주 후 6.4%의 주름 개선 효과를 나타내었다. 평가 기간 동안 시험 제품에 의한 피부 유해 사례는 발생하지 않았으며, 분석 결과는 아래의 표에 나타내었다(Table 4). 또한 PRIMOS 사진을 통하여 눈가 주름이 변화된 모습을 확인할 수 있었다(Table 5).
| Before | After 2 weeks | After 4 weeks |
|---|---|---|
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Ⅳ. 고 찰
크게 두 가지로 나눠지는 피부 노화 중 자연 노화와 광 노화에 대한 대안책으로 본 연구를 실시하였다. 해송자는 학명에서조차 국내 원산지라는 표현의 koreaiensis를 사용하고 한국 사람들에게 친근하고 사 용에 있어 부담이 없는 한방 천연물이며 《本草綱目》5)에서는 “新羅松子 有斑極香;新羅者肉甚香美”라고 하여 해송자의 주산지가 한국이며, 한국산 해송자를 매우 향기롭고 맛있다고 표현하였다. 해송자는 뛰어난 식감으로 식재료로 주로 사용되었기에 韓醫學에서는 그 사용례가 많지 않았다. 해송자를 치료용으로 사용한 대표적인 사례는 《本草綱目》5)으로 “骨節風, 頭眩, 去死肌, 變白, 散水氣, 潤五臟, 不飢. 開寶 逐風痺寒氣, 虛羸少氣, 補不足, 潤皮膚, 肥五臟.別錄 主諸風, 溫腸胃. 久服, 李珣, 潤肺, 治燥結欬嗽.時珍 同栢子仁, 治虛秘.宗奭” 라고 제시되어있다. 이중 潤皮膚에 중점을 두고 본 연구를 실시한 결과 해송자 문헌을 찾아보면 일반 성분 중 지방이 60-70%로 들어 있어 지방의 효과를 확인 하였으며 이 지방은 불포화 지방산인 올레산이 약 50%를 차지하고 있는 것을 확인하였다. 올레산을 다량으로 함유하고 있는 지방들은 이미 항산화 효과가 있다는 사실은 연구를 통하여 많이 보고되어지고 있다13,14). 또한 다음으로 분석된 리놀레산은 오메가-6 지방산으로 체내에서 식이로서 우리 몸에 공급해 주어야 하는 필수 지방산 중에 하나이다.
또한 proteom 분석을 통하여 확인한 결과에서 총 15가지 단백질 변화는 큰 의미가 있다. 콜라겐 합성 경로의 6가지 단백질 중 iso형인 P4HA2, P4HA3들이 만들어 내는 효소인 P4H2, P4H3는 증가될수록 콜라겐 합성에 도움을 준다는 연구가 되어있으며19,20), P3H2, P3H3 역시 하이드록실화를 촉매시키면서 콜라겐 합성에 도움을 준다. 또한 증가됨으로 분석되어진 catalase는 superoxide dismutase(SOD)에 의해 분해된 과산화수소를 산소와 물로 분해시키면서 콜라겐 합성을 촉진해준다.
Interleukin-1(IL-1) 역시 type I, III의 procollagen mRNA의 정상 상태 수준을 감소시키고 조직의 리모델링, 염증, 면역, 재생 과정 등의 생물학적 과정에 관여하고 있다21). 위의 단백질 모두 해송자오일을 처리하지 않은 control에 비하여 매우 증가되고 감소되는 것을 확인하여 피부 내 어떠한 노화메커니즘에 효과가 있는 것을 확인한 것뿐만 아니라 실제 인체 적용 시험에서도 충분한 효과가 있을 것이란 기대감을 갖고 in vitro 실험의 결과를 얻게 되었다.
인체 적용 시험 결과 또한 6% 이상 효과가 있는 것을 확인 할 수 있어 해송자유는 피부의 항노화, 항주름 효과가 있음을 증명하였다.
Ⅴ. 결 론
본 연구는 해송자오일의 지방산 조성을 분석하고 항산화 효능과 proteom 분석을 통하여 항노화 메커니즘에 작용하는 단백질의 변화를 확인하였다. 이후 인체 적용 시험을 통하여 눈가 주름의 개선율을 확인하여 해송자오일의 주름 개선 효과를 확인하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
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해송자를 사용하여 초임계이산화탄소로 오일을 추출하였다. 약 68%의 추출수율을 확인하였으며 이 추출된 오일은 37종의 지방산 표준물질로 분석한 결과 10가지 지방산이 분석되어졌고 그 중 불포화 지방산인 Oleic acid이 49.7%의 가장 많은 조성을 보였고 Linoelic acid이 두 번째로 많은 34.1%로 분석되었다.
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Beta-carotene을 이용한 항산화 평가에서 모두 농도 의존적으로 효과가 있는 경향을 보였다. 최고 농도에서 항산화제인 0.1% alpha-tocopherol 보다 약 25% 더 효과를 보이는 것을 볼 수 있었다.
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인간섬유아세포에 해송자오일을 처리하여 proteom 분석을 통하여 각 메커니즘에 작용하는 단백질들을 살펴본 결과 콜라겐 합성경로에 있는 6가지 단백질, interukin, 항산화 효소들은 증가되는 것을 확인 할 수 있었으며, cytokines, MMPs는 감소되는 것을 확인하여 항산화 효과를 확인하였다.
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승인된 연구기관을 통하여 4주간의 인체 적용 시험을 한 결과, 눈가의 주름이 약 6% 이상 개선되는 것을 확인 할 수 있어 주름 개선에도 효과가 있는 것을 확인 할 수 있었다.
