衛生湯의 LPS로 유도된 RAW264.7 세포에서 염증매개체에 대한 억제효과

Ⅰ. 서 론

염증은 만성 통증, 심혈관 질환, 노화, 자가 면역 질환 등에 대한 인체의 방어기전이다¹⁾. 그러나 지속적인 염증반응은 만성염증질환 및 종양 등의 유발 원인이 되기도 한다²⁾. Lipopolysaccharide(LPS)는 인지질, 다당류 및 소량의 단백질로 구성되어 있으며 염증반응을 유발하는 인자로 다양한 cytokine과 염증매개물질을 생성시킨다. 그리하여 염증반응을 연구하는 경우 자주 사용하는 실험모델로 확립되어 있다⁵⁾. LPS 등과 같은 일차적인 자극에 의해서⁴⁾ 염증반응이 일어나게 되면 대식세포와 같은 면역세포들은 NF-κB로 부터 시작하여 초기 염증반응 유도 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)인 interleukin(IL), tumor necrosis factor-alpha(TNF-α)와 염증매개물질인 cyclooxygenase-2(COX-2), inducible NOS(iNOS)등을 분비한다³⁾. 이와 같은 염증매개물질들의 형성은 arachidonic acid가 leukotriene, thromboxane, prostaglandin 등으로 바뀌는 과정 및 nitricoxide(NO)의 대량 생성에 관여하게 되며, 숙주에 치명적 결과를 초래한다고 알려져 있다⁶⁾. 이 중 NO는 반응성이 높은 물질로 NO synthase(NOS)는 L-arginine으로부터 생성되며 NOS는 constitutive NOS와 iNOS로 나누어진다. 과잉 생산된 NO는 조직의 손상, 유전자 변이, 신경 손상⁷⁾, 혈관 투과성 및 부종 등의 염증반응을 촉진한다고 보고되고 있다. 즉, iNOS와 COX-2의 발현과 NO, prostaglandin E₂(PGE₂)의 생성은 면역세포의 대표적인 염증반응이라고 볼 수 있다^6,8).

최근 천연을 선호하는 소비자의 기호성 증대와 더불어 사회 전반적인 웰빙 열풍을 타면서 한약 및 생약재를 이용한 신제품을 개발하려는 시도가 많이 이루어지고 있다. 衛生湯(Wisaengtang, WST)은 《醫學心悟 附錄 外科症治方藥》⁹⁾에 수록되어 있는 처방으로 白芷, 連翹, 天花粉, 荊芥, 甘草, 牛蒡子, 防風, 乳香, 沒藥, 金銀花, 貝母, 當歸尾로 구성되어 있고, “解毒消癰 淸熱 活血 止痛 初起相宜” 하는 효능으로 염증반응의 억제에 사용 가능한 처방으로 생각되나, 현재까지 본 처방에 대한 실험적 연구는 미비한 실정이다. 이에 본 연구에서는 WST가 LPS로 활성된 RAW 264.7 cell에서 cytokine 및 염증매개물질의 변화에 미치는 영향을 살펴보았다.

Ⅱ. 재료 및 방법

Ⅲ. 결 과

1. 세포 생존율

WST의 농도별 세포 생존율을 확인하기 위하여 배양 한 세포에 WST를 농도별(25, 50, 100, 200 and 400㎍/㎖)로 24시간 동안 처리하여 세포생존율을 측정하였다. 그 결과 세포생존율은 대조군에 비해서 각 102.08 ± 5.10%, 101.29 ± 2.59%, 101.57 ± 6.15%, 91.75 ± 1.46% 및 75.53 ± 3.38%로 나타났다. 400㎍/㎖농도부터는 독성이 있는 것으로 판단하여 200㎍/㎖농도까지 다음 실험을 진행하였다(Fig. 1).

Fig. 1. Effect of WST on Cytotoxic in RAW 264.7 Cells. Con: untreated group; 25, 50, 100, 200 and 400: treated with WST(25, 50, 100, 200 and 400㎍/㎖). *p<0.05 indicates different from control group.

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2. NO생성억제 효과

WST의 RAW264.7 cells에서의 NO생성억제의 효과를 관찰하였다. 배양한 세포에 LPS와 WST(25, 50, 100 and 200㎍/㎖)를 24시간 동안 처리하였을 때 LPS만 처리한 세포에서는 NO의 생성량이 683.58 ± 32.23%로 나타났고, LPS와 WST를 함께 처리한 세포에서는 농도별로 652.23 ± 18.53%, 615,76 ± 25.80%, 614.11 ± 16.98% 및 567.76 ± 18.3%로 WST의 농도가 증가함에 따라 유의성 있게 NO생성이 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 2).

Fig. 2. Effect of WST on NO Production in RAW 264.7 Cells. Con: untreated group; LPS: treated with LPS(1㎍/㎖); 25, 50, 100 and 200: treated with LPS and WST(25, 50, 100, 200㎍/㎖). *p<0.05 compared to the control group.

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3. Real-time PCR

1) COX-2의 유전자 발현 억제 효과

WST가 COX-2의 mRNA발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 real-time PCR을 실행하였다. 배양한 세포에 LPS와 WST(25, 50, 100 and 200㎍/㎖)를 24시간 동안 처리하였을 때 LPS만 처리한 세포에서는 COX-2의 발현량이 1219.62 ± 78.01%로 나타났고, LPS와 WST를 함께 처리한 세포에서는 농도별로 987.41 ± 67.10%, 942.84 ± 37.72%, 932.98 ± 33.59% 및 869.59 ± 76.41%로 나타났다. WST의 농도가 증가함에 따라 유의성 있게 COX-2 발현이 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 3).

Fig. 3. Effect of WST on LPS-induced Expression of COX-2 mRNA. Con: untreated group; LPS: treated with LPS(1㎍/㎖); 25, 50, 100 and 200: treated with LPS and WST(25, 50, 100 and 200㎍/㎖). *p<0.05 compared to the control group.

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2) iNOS의 유전자 발현 억제 효과

WST가 iNOS의 mRNA 발현량에 미치는 영향을 확인하기 위하여 real-time PCR을 실행하였다. 배양한 세포에 LPS와 WST(25, 50, 100 and 200㎍/㎖)를 24시간 동안 처리하였을 때 LPS만 처리한 세포에서는 iNOS의 발현량이 74.89 ± 10.25%로 나타났고, LPS와 WST를 함께 처리한 세포에서는 농도별로 82.71 ± 13.72%, 70.01 ± 7.88%, 32.93 ± 1.94% 및 8.86 ± 1.30%로 나타났다. WST를 농도별로 처리한 결과 농도의존적으로 iNOS의 mRNA의 발현이 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 4).

Fig. 4. Effect of WST on LPS-induced Expression of COX-2 mRNA. Con: untreated group; LPS: treated with LPS(1㎍/㎖); 25, 50, 100 and 200: treated with LPS and WST(25, 50, 100 and 200㎍/㎖). *p<0.05 compared to the control group.

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3) IL-6의 유전자 발현 억제 효과

WST가 IL-6의 발현량에 미치는 영향을 확인하기 위하여 real-time PCR을 실행하였다. 배양한 세포에 LPS와 WST(25, 50, 100 and 200㎍/㎖)를 24시간 동안 처리하였을 때 LPS만 처리한 세포에서는 IL-6의 발현량이 22.75 ± 1.89%로 나타났고, LPS와 WST를 함께 처리한 세포에서는 농도별로 17.95 ± 2.28%, 17.10 ± 0.92%, 16.13 ± 2.13% 및 14.49 ± 4.61%로 나타났다. WST의 농도가 증가함에 따라 IL-6의 mRNA의 발현량이 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 5).

Fig. 5. Effect of WST on LPS-induced Expression of IL-6 mRNA. Con: untreated group; LPS: treated with LPS(1㎍/㎖); 25, 50, 100 and 200: treated with LPS and WST(25, 50, 100, 200㎍/㎖). *p<0.05 compared to the control group.

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4) NF-κB의 유전자 발현 억제 효과

WST가 NF-κB의 발현량에 미치는 영향을 확인하기 위하여 real-time PCR을 실행하였다. 배양한 세포에 LPS와 WST(25, 50, 100 and 200㎍/㎖)를 24시간 동안 처리하였을 때 LPS만 처리한 세포에서는 NF-κB의 발현량이 7.34 ± 0.29%로 나타났고, LPS와 WST를 함께 처리한 세포에서는 농도별로 7.89 ± 0.53%, 7.12 ± 0.70%, 6.29 ± 0.48% 및 5.70 ± 0.48%로 나타났다. WST의 농도가 증가함에 따라 NF-κB의 발현량이 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 6).

Fig. 6. Effect of WST on LPS-induced Expression of NF-κB mRNA. Con: untreated group; LPS: treated with LPS(1㎍/㎖); 25, 50, 100 and 200: treated with LPS and WST(25, 50, 100 and 200㎍/㎖). *p<0.05 compared to the control group.

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4. DPPH radical 소거능 측정

WST의 항산화력을 측정하기 위하여 DPPH radical 소거능을 확인하였다. 대조군으로 radical 소거율이 뛰어난 ascorbic acid(AC)와 WST를 농도별(25, 50, 100 and 200㎍/㎖)로 처리한 결과 AC는 radical 소거율이 88.07 ± 0.27%로 나타났고, WST는 농도별로 1.76 ± 1.23%, 6.82 ± 2.07%, 28.05 ± 1.09% 및 58.48 ± 0.99%로 나타났다. WST의 농도가 증가할수록 radical 소거율도 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 7).

Fig. 7. Effect of WST on DPPH Radical Scavenging Test. AC: treated with ascorbic acid. 25, 50, 100 and 200㎍/㎖: treated with various concentrations of WST.

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Ⅳ. 고 찰

WST는 淸代 程國彭의 《醫學心悟 附錄 外科症治方藥》⁹⁾에 수록되어 있으며 “解毒消癰 淸熱 活血 止痛 初起相宜” 이라 하여 癰을 치료하는 처방으로 제시되어 있다. 한의학 피부질환 중의 하나인 癰은 體表의 皮肉之間에 발생하는 急性 化膿性 疾患의 일종으로 部位가 浮淺하며 局部가 光軟無頭하며 紅腫疼痛하면서 發病이 신속하고 易腫, 易膿, 易潰, 易斂하며 혹 惡寒, 發熱, 口渴 등 全身症狀이 나타나는 특징이 있다¹⁰⁾. 이와 같은 癰의 특징은 통증, 열감, 발적, 기능저하의 증상을 보이는 조직 손상에 대한 자가 방어능력 중의 하나인 염증 반응의 산물이라 볼 수 있다¹¹⁾.

염증반응성 질환인 癰의 치료에 사용하는 WST는 白芷, 連翹, 天花粉, 荊芥, 甘草, 牛蒡子, 防風, 乳香, 沒藥, 金銀花, 貝母, 當歸尾로 구성된 처방으로 약재별 항염효과에 대해서는 다음과 같이 연구되어져있다. 白芷는 furanocoumarin류의 화합물로서 imperatorin을 함유하며, imperatorin은 LPS로 유도된 COX-2의 발현 및 PGE synthase의 발현을 현저히 억제하는 것으로, 連翹는 5-lipoxygenase 및 elastase에 대한 억제 활성 및 free radical 생성 시스템에서 지질과산화를 억제하는 것으로, 荊芥는 COX-2 및 iNOS 발현 억제 및 Th1·Th2 세포에서 cytokine 유리 억제에 효과가 있는 것으로, 牛蒡子는 electron spin resonance spectrometer 측정 시 활성산소 제거능이 있는 것으로, 防風은 furanocoumarin류의 화합물로서 imperatorin 및 deltoin을 함유하며, imperatorin 및 deltoin은 iNOS의 발현을 억제하여 NO의 유리를 현저히 줄이는 효과가 있는 것으로, 沒藥은 IL-1β로 유발된 염증 상황에서 IL-6와 IL-8의 생성을 감소시키는 효과가 있는 것으로, 金銀花는 TNF-α의 분비 및 iNOS의 활성화를 일부분 감소시키는 효과가 있는 것으로¹²⁾, 天花粉은 LPS로 유도된 염증 상황에서 NO를 감소시키는 효과가 있는 것으로¹³⁾, 甘草는 iNOS 활성화 억제 및 NO, PGE2를 감소시키는 효과가 있는 것으로¹⁴⁾, 乳香은 LPS로 유도된 염증 상황에서 iNOS의 mRNA을 감소시킴으로써 NO를 억제하는 것으로¹⁵⁾, 貝母는 MAPK를 이루는 JNK와 P38의 인산화를 억제하여 염증성 사이토카인인 IL-4와 TNF-α의 발현을 억제하는 것으로¹⁶⁾, 當歸는 DNCB로 유도된 염증 상황에서 TNF-α, IL-6, COX-2를 억제 하는 것으로 알려져 있다¹⁷⁾.

WST를 구성하는 개별 약재들의 항염효과는 상술한 것과 같이 연구가 되어 있으나, 개별 약재들의 복합물인 WST의 경우 연구가 전무한 상황이기에 본 연구는 LPS로 유도된 RAW264.7 cells에서 열수추출된 WST의 항염효과를 평가하였다.

염증반응에 주요한 역할을 하는 NO는 반응성이 높은 물질로 L-arginine과 O₂로부터 NOS를 거쳐 생성되는 radical이다. NO의 생성은 혈액응고, 혈압 및 신경전달 기능을 조절한다. 하지만 과다 생성된 NO는 유해물질을 생성하여 생체에 치명적인 산소독성을 일으키며 염증의 유발과 세포막 분해, 단백질 분해, DNA변성, 지질 산화 등을 초래하여 염증을 비롯해 노화, 자가면역질환, 암 등 각종 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다^3,18). 그렇기에 NO 생성의 감소는 염증반응을 조절하는 가능성 때문에 많은 연구가 진행되고 있다. 본 연구에서 WST는 LPS에 의해 과도하게 생성된 NO의 함량을 농도의존적으로 감소하여 항염증 효과를 보였다(Fig. 2).

iNOS는 염증 반응을 촉진하기 위해 COX-2와 시너지 효과를 발휘한다¹⁹⁾. 염증과정에서 염증성 매개체인 NO와 PGE₂가 iNOS와 COX-2에 의해 생성된다²⁰⁾. NO는 NOS를 거쳐 생성되는 물질로써, WST의 NO생성억제에 iNOS의 mRNA가 관여하는지 알아보기 위하여 iNOS의 mRNA발현량을 조사하였다. LPS 처치 시 iNOS의 mRNA가 발현되었으며, LPS에 WST를 농도별로 처치한 실험군에서는 iNOS의 mRNA발현량이 농도의존적으로 감소하였다(Fig. 4).

COX-1은 대부분의 포유동물 조직에서 발현되고 위 점막의 세포보호, 신장 혈류조절 및 혈소판 응집 조절과 같은 생리기능 유지에 관여하는 것으로 알려져 있다. 반대로 COX-2는 정상적인 생리 조건에서 나타나지 않지만 염증을 유발하는 인자 등에 의해 일시적으로 유도될 수 있다. COX-2가 과발현하게 되면 악성세포 또는 형질 전환 된 세포의 생존을 연장시킨다²¹⁾. COX는 arachidonic acid를 PG로 전환시키는 효소로서 대표적으로 COX-2는 cytokine, 염증반응, 성장촉진인자 등에 의해 유도되어 다량의 PG를 생성함으로써 염증관련질병, 자가면역성질환 등에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다^2,21). 본 실험에서 COX-2는 LPS 처치 시 mRNA의 발현이 유의하게 증가되었으며, LPS에 WST를 처치한 실험군에서는 농도의존적으로 COX-2의 mRNA발현과 활성을 억제하였다(Fig. 3).

한편 면역반응 및 세포주기의 조절과 세포 생존 유전자의 조절로 대표적인 염증관련진핵세포 전사조절인자 NF-κB는 COX-2, iNOS 및 IL-6 등과 같은 pro-inflammatory cytokine 및 염증매개물질의 발현을 조정하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다^22,23). 최근 연구들은 NF-κB가 LPS 등의 염증유발 자극에 의해 NF-κB pathway가 활성화되어 iNOS나 COX-2 등 유전자 발현에 관여함을 입증했다²¹⁾. NF-κB가 핵 안으로 전위하여 iNOS 및 COX-2의 전사를 유도하는데, 전사과정에서 NF-κB의 mRNA발현량은 LPS에 의해 유의성 있게 증가되었으며, LPS에 WST를 처치한 실험군에서는 NF-κB의 mRNA발현량이 유의하게 감소하였다(Fig. 6).

단핵구나 macrophage cell에서 분비되는 lL-6는 pro-inflammatory cytokine으로서 iNOS의 발현을 자극하여 NO의 생성을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 또한 IL-6는 B cell이 plasma cell로 분화되어 항체의 생산을 증가시키는 것으로, IL-6의 level은 염증성 병변에서 항상 증가하는 것으로 보고되고 있다^4,24). 본 실험에서 LPS에 의해 IL-6의 분비를 증가시켰으며, WST는 LPS로 유도된 IL-6를 농도의존적으로 유의성 있게 감소시켰다(Fig. 5).

유해산소라 불리는 활성산소는 에너지 대사과정에서 생산된다. 생성된 활성산소는 생체에 산소독성을 일으키며 여러 질환의 원인이 되고 있다^19,25). 본 실험에서 WST는 DPPH radical 소거율을 농도의존적으로 유의성 있게 증가시켰다(Fig. 7).

이상의 결과는 WST가 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포의 염증매게물질에 대한 억제효과 가 있음을 확인하였다. 따라서 이러한 WST의 염증 억제효과는 아토피 피부염, 류마티스 관절염 등의 염증성 제반 질환에 활용할 수 있을 것으로 판단된다. 하지만 본 연구에서는 WST가 어떠한 기전으로 항염증 및 항산화 효과를 내는지에 대해서는 밝히지 못하였기에 향후 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

Ⅴ. 결 론

본 연구는 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포의 염증반응에 대한 衛生湯(WST)의 염증매개물질에 대한 억제효과를 확인하기 위하여 진행하였으며, 다음과 같은 결론을 얻었다.